交聯染色質免疫沉淀(ChIP)方案
用法說明
ChIP(染色質免疫共沉淀)是一種用于研究蛋白與DNA之間自然狀態下相互作用的技術。它依賴于特定抗體與抗原的特異性反應,因此能夠真實地反映蛋白因子與基因組DNA在體內的結合情況。目標蛋白與DNA被交聯在一起,然后通過聲波或酶切將DNA打斷成小片段。通過抗體與抗原之間的特異性反應,我們可以沉淀下預測的DNA片段。這個過程特異性地富集了與目標蛋白結合的DNA片段。最后,我們可以從復合物中純化DNA,并根據PCR或qPCR方案驗證DNA。
溶液和試劑
ChIP溶解緩沖液:1% TritonX-100,0.1% NaDOC,0.1% SDS,1mM EDTA(pH8.0),140mM NaCl,50mM Tris-HCl(pH8.0)
RIPA緩沖液:1% NP-40,0.5% NaDOC,0.1% SDS,2mM EDTA(pH8.0),150mM NaCl,50mM Tris-HCl(pH8.0)
低鹽洗滌緩沖液:1% TritonX-100,0.1% SDS,2mM EDTA(pH8.0),150mM NaCl,20mM Tris-HCl(pH8.0)
高鹽洗滌緩沖液:1% TritonX-100,0.1% SDS,2mM EDTA(pH8.0),500mM NaCl,20mM Tris-HCl(pH8.0)
LiCl緩沖液:0.25M LiCl,1% NP-40,1% NaDOC,1mM EDTA,10mM Tris-HCl(pH8.0)
TE緩沖液:1mM EDTA,10mM Tris-HCl(pH8.0)
洗脫緩沖液:1% SDS,100mM NaHCO3
樣品制備
● 交聯和裂解-轉錄因子和輔助因子
細胞在10厘米培養皿中以20毫升培養基進行培養。當細胞密度達到80%至90%時,可用于進行ChIP實驗。細胞數量的選擇取決于您研究的目標蛋白質。您可以參考以下表格:
蛋白質 | 細胞數(用于ChIP反應) | 蛋白靶豐度 |
---|---|---|
組蛋白蛋白質RNA聚合酶II | 104 | 高 |
轉錄因子 | 105-106 | 中等 |
輔因子 | 107?或更多 | 低 |
為了獲得更好的結果,對于組蛋白蛋白和RNA聚合酶II,我們建議使用超過4×106個細胞,而轉錄因子或輔因子可能需要更多細胞。我們使用1%的甲醛作為交聯劑,將蛋白質與DNA交聯在一起。這個過程是時間依賴性的,所以我們需要針對不同的細胞進行優化。交聯不足會導致假陰性結果,而過度交聯可能會掩蓋表位,導致假陽性結果。我們建議將樣品交聯10分鐘。交聯反應可以通過甘氨酸來逆轉。
1. 將培養皿取出,向20ml培養基中加入550μl的37%甲醛。充分混合,使最終甲醛濃度達到1%。
2. 將培養皿放置在室溫下靜置10分鐘。這個過程是蛋白質和DNA之間的交聯反應,時間不宜過長,否則會導致假陽性結果。
3. 加入125mM甘氨酸溶液終止交聯反應。輕輕混合溶液。
4. 將培養皿放置在室溫下靜置5分鐘。
5. 去除培養基,用冰冷PBS洗滌細胞3次。
6. 向培養皿中加入含有蛋白酶抑制劑的1ml冰冷PBS,并迅速刮取細胞。
7. 用適量的PBS洗滌培養皿底部2次。將PBS吸入步驟6中的離心管中。
8. 以2500rpm、4℃離心3分鐘,收集沉淀物。
9. 向細胞懸浮液中加入適量的ChIP裂解緩沖液(2×107細胞使用1ml),在冰上裂解細胞15分鐘。
10. 超聲處理細胞,以打斷DNA,理想的DNA片段大小為200-1000bp。超聲處理的條件因細胞類型和使用的設備而異。對于每種細胞,您需要探索相應的超聲處理條件。
11. 以12000rpm、4℃離心10分鐘。
● 聲處理
超聲處理過程也是時間相關的。理想的DNA片段大小為200-1000bp,需要根據不同的細胞系進行優化。
1. 超聲處理細胞,打斷DNA,理想的DNA片段大小為200-1000bp。超聲處理的條件因細胞類型和使用的設備而異。對于每種細胞,您需要探索相應的超聲處理條件。
2. 以12000rpm、4℃離心10分鐘。將上清液分離到一個新的離心管中。
3. 取50μl上清液進行瓊脂糖凝膠分析,以驗證超聲處理的效果。
● DNA片段的測定
1. 將70μl洗脫緩沖液加入50μl染色質中。
2. 加入4.8μl 5M NaCl和2μl 10mg/ml RNase A,在65℃孵育過夜。目的是去除RNA的干擾。
3. 加入2μl 20mg/ml蛋白酶K,在60℃孵育1小時。目的是打斷蛋白與DNA之間的反應,并有助于DNA的純化。
4. 使用DNA純化試劑盒富集DNA,或進行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀法。
5. 使用2%瓊脂糖凝膠檢測超聲處理效果。
免疫沉淀反應
1. 將包含來自1×107細胞的DNA的500μl染色質(用RIPA緩沖液稀釋)轉移至離心管,并取50μl染色質作為輸入組。
2. 在免疫沉淀前,您需要設計四組實驗:
- 實驗組:將2-5μg特異性初級抗體加入500μl染色質中,并將離心管放置在4℃的旋轉混合器上過夜,形成抗原-抗體復合物。
- 輸入組:除了免疫沉淀反應外,所有步驟都與實驗組相同。
- 陰性對照組:所有步驟與實驗組相同,但使用正常兔IgG代替抗體。
- 陽性對照組:所有步驟與實驗組相同,但使用組蛋白H3或RNA聚合酶II抗體代替抗體。
3. 在4℃下將50μl磁珠加入復合物溶液中,孵育2-4小時。
4. 將磁珠吸附在磁架上并去除上清液。
洗掉珠子
1. 使用過濾吸頭對磁珠進行洗滌:
- 2×1ml 低鹽洗滌緩沖液
- 2×1ml 高鹽洗滌緩沖液
- 2×1ml LiCl洗滌緩沖液
- 2×1ml TE緩沖液
依次使用上述緩沖液對磁珠進行兩次洗滌。每次使用吸頭吸液3-8次,并旋轉攪拌10分鐘。
2. 使用磁架去除洗滌緩沖液并收集沉淀復合物。
反交聯
1. 將120μl洗滌緩沖液加入沉淀復合物中,在旋轉混合器上以室溫慢慢混合15分鐘。
2. 重復上述步驟一次。
3. 使用磁架將上清液收集到一個新的管中。
4. 將9.6μl 5M NaCl和2μl 10mg/ml RNase加入所有組中,然后在65℃水浴中過夜以解除交聯作用。
5. 加入2μl 20mg/ml蛋白酶K,在60℃孵育1小時。
DNA純化
您可以根據提取試劑盒的說明書進行DNA提取,或者使用苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀方法進行提取。