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如何選擇上樣對照抗體

日期:2023-07-26 09:33:49

對照抗體,顧名思義,是一系列的內部對照抗體。一般而言,對照抗體可以分為兩組,包括同型對照抗體和負載對照抗體。

同型對照抗體指的是一組原抗體,它們對目標物并不具備特異性,但與實驗中使用的原抗體屬于相同的類別和類型,尤其是在流式細胞術實驗中。同型對照抗體被用作陰性對照,以幫助區分非特異性背景信號和特異性抗體信號。

負載對照抗體被稱為在幾乎所有組織和細胞中以恒定且穩定的高水平表達的抗體。負載對照蛋白提供了一個參考,用于評估目標蛋白表達水平的變化,并幫助確保目標蛋白水平的增加或減少是由于實驗操作而不是由于免疫印跡過程中的誤差引起的。常見的負載對照蛋白,如GAPDH、微管蛋白和肌動蛋白,被視為一些眾所周知的負載對照蛋白。

CUSABIO提供多種單克隆負載對照抗體選擇,包括GAPDH、α-微管蛋白和β-肌動蛋白的多個物種。同時還提供了與辣根過氧化物酶(HRP)和生物素結合的版本。在本文中,我們主要關注負載對照抗體,并列出了關于CUSABIO負載對照抗體的一些問題。此外,在最后一部分,我們介紹了五種常見的負載控制蛋白和抗體。


1. 在Western blot中負載對照抗體的目的是什么?

估計每個泳道中加載的總蛋白質量。這個信息是為了確定在不同樣本中感興趣蛋白質水平的差異是否由于加載和轉移錯誤,還是由于蛋白質表達的真實變化。

對Western blot過程進行故障排除。負載對照抗體可以幫助確定實驗過程中是否存在問題,并幫助確定可能的錯誤來源。


2. 在實驗中選擇合適的負載對照抗體的重要因素是什么?

如前所述,負載對照抗體是可以監測整個檢測系統是否正常的參考對象,如蛋白質提取過程、膜轉移系統、顏色顯像系統等。也可用于比較不同條件下不同細胞組織中靶蛋白的表達。在選擇合適的載藥對照抗體作為內參時,需要注意以下幾個方面。

樣本來源:在哺乳動物組織或細胞中,主要代表性的負載對照抗體有肌動蛋白、微管蛋白、GAPDH、Lamin B1和PCNA。但如果是植物樣本,主要代表性的負載對照抗體有肌動蛋白和GAPDH。

目標蛋白分子量:常見的負載對照抗體包括β肌動蛋白、β微管蛋白和GAPDH,它們的分子量分別為42 kDa、50 kDa和37 kDa。目標蛋白的分子量最好與內部參考蛋白的分子量相差5 kDa以上,以便區分目標蛋白和內部參考蛋白。

目標蛋白的表達位點:在不同的表達位點,基礎蛋白的特征不同。例如,微管蛋白、β肌動蛋白和GAPDH是全細胞蛋白,PCNA的定位在細胞核,Lamin B1位于核膜等。表格1總結了常見基礎蛋白的特點,包括名稱、類型和分子量。

表1. 常見管家蛋白的特征

蛋白名稱 表達位點 分子量
β-Actin 全細胞/細胞骨架 40 kDa
GAPDH 全細胞 36 kDa
Beta-Tubulin 全細胞 55k Da
PCNA 細胞核 28 kDa
Histone H3 細胞核 18 kDa
COX IV 線粒體 16 kDa
植物肌動蛋白 植物全細胞 42 kDa
α-Actin 全細胞 42 kDa
α-Tubulin 細胞膜/細胞骨架 50 kDa
VDAC1 線粒體 31 kDa
Lamin B1 細胞核 66 kDa
PCNA 細胞核 30 kDa
NaK ATPase 細胞膜 110 kDa

3. 五種常見的負載對照抗體

在這部分中,我們列出了CUSABIO提供的五種常見的負載對照抗體。

3.1 Beta-Actin負載對照抗體

肌動蛋白是細胞的重要細胞骨架蛋白,可以大致分為六種類型。其中,四種肌動蛋白是特異性表達于不同肌肉組織中,而其他兩種則廣泛分布于各種組織中,包括β-肌動蛋白和γ-非肌肉肌動蛋白。β-肌動蛋白被認為是大多數組織和細胞的內部參考基因。

β-肌動蛋白廣泛分布于細胞質中,在所有細胞的總蛋白中豐度較高,約占總蛋白的50%。然而,在一些特殊情況下,如脂肪組織或細胞內,β-肌動蛋白的表達量很低。它由375個氨基酸組成,分子量約為42-43 kDa。它適用于在WB實驗中檢測38kD-48kD大小的目標蛋白。但是,在脂肪組織中,β-肌動蛋白的表達量非常低,不適合作為內部參考基因。

3.2 GAPDH負載對照抗體

GAPDH,也稱為糖酵解中的糖醛酸-3-磷酸脫氫酶,是參與糖酵解的關鍵酶。它由四個亞單位組成(每個亞單位約為30-40 kDa),其分子量約為146 kDa,檢測帶大約為36 kDa。GAPDH基因在幾乎所有組織中表達水平高,并且可以廣泛用作Western blot蛋白質標準化的內部參考基因。但請注意,在WB實驗中,它不適用于檢測30kD-40kD大小的目標蛋白。此外,在某些細胞中,由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增加,因此也不適合作為內部參考基因。

3.3 β-Tubulin負載對照抗體

微管蛋白和肌動蛋白一樣,也是一種細胞骨架蛋白。微管蛋白可分為α、β、γ、δ、ε等多種微管蛋白。其中,α-Tubulin和β-Tubulin可形成異二聚體,是形成微管的兩種主要的Tubulin類型。α-微管蛋白和β-微管蛋白的相對分子質量分別為55kDa和50kDa,其實際檢測條帶均在55kDa左右。

β-tubulin作為內部參考,通常不會發生蛋白水平的變化,因此更廣泛地用于Western Blotting中樣品上樣是否一致的參考,并常用于免疫染色觀察細胞的微管結構。但是,需要注意的是,對于50kD-60kD大小的目標蛋白不適合進行WB實驗。此外,在脂肪組織或細胞中,β- Tubulin很少表達,不適合作為內部參考。

3.4 PCNA負載對照抗體

增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,簡稱PCNA)最早于1978年由Miyachi在SLE(全身性紅斑狼瘡)患者的血清中發現并命名,僅在正常增殖細胞和腫瘤細胞中存在。PCNA是一種分子量為36kDa的蛋白質,其在細胞核中合成,并存在于細胞核中,是DNA聚合酶的輔助蛋白。由于其在細胞核中的穩定表達,其抗體被廣泛應用于核蛋白的內部參考抗體中。

除了Histone H3和PCNA之外,其他常見的核蛋白內部參考還包括K70、K80、Lamin A和B。在一些研究中,還使用Erk2、TATA結合蛋白(TBP)、c-Jun、c-Fos等。然而,除了考慮目標蛋白的分子量之外,選擇核蛋白內部參考還需要考慮實際的實驗環境。例如,在涉及細胞增殖的實驗中,由于其自身表達的變化,c-Jun不適合作為內部參考。在這種實驗中,TBP、Lamin等也不適合作為內部參數。

3.5 COX IV負載對照抗體

細胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase,簡稱COX)是線粒體呼吸鏈的酶復合物,是一個異源多聚酶,通常包含13個亞單位,位于線粒體內膜上。形成細胞色素c氧化酶催化中心的三個最大的亞單位由線粒體DNA編碼,剩余的10個亞單位,包括COX IV,由細胞核內的基因組DNA編碼。細胞色素c氧化酶(COX)活性缺陷與多種人類疾病相關。COX IV抗體可以用作線粒體蛋白質加載的內部參考抗體,目標蛋白的大小約為16 kDa。

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