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高效通用型CAR陽性率檢測工具:抗CAR Linker抗體

抗CAR Linker抗體

CAR-T療法是一種將患者自身的T細胞通過基因工程改造,使其表達特異性的嵌合抗原受體(CAR),從而增強其對癌細胞的識別和攻擊能力的免疫療法。該療法在一些惡性腫瘤,特別是在某些難治性血液癌癥的中展現出了驚人的療效。

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CAR生“萬物”:從CAR-T到CAR-X

隨著對免疫系統的深入了解,CAR技術的應用范圍正不斷拓寬,新型CAR細胞療法的開發逐漸成為熱點,如CAR-NK、CAR-M、CAR-Treg和CAR-γδ等。相比CAR-T療法潛在的不良反應和無法應用于實體瘤治療的痛點,這些新型CAR細胞療法存在各自的優勢,為免疫療法的蓬勃發展注入了新的活力。

CAR的基本結構

無論是CAR-T,還是CAR-NK、CAR-M,它們都具有相似的CAR結構。CAR結構主要包括三個部分:胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域。

胞外結構域通常是一個單鏈可變片段(scFv),該片段由一個linker將抗體的可變重鏈(VH)和可變輕鏈( VL)連接形成,用于識別腫瘤抗原;一段鉸鏈區將scFv與跨膜域相連,提供克服空間位阻的靈活性,以允許scFv進入靶向表位;跨膜結構域的主要功能是確保CAR穩定嵌入細胞膜;胞內結構域則包括共刺激結構域和信號轉導結構域,用于激活和增強免疫細胞的反應。

Structural elements of a chimeric antigen receptor(CAR)

Structural elements of a chimeric antigen receptor(CAR)

Rodríguez-Lobato LG, et al. Front Oncol. 2020.

為什么進行CAR檢測?

目前,隨著越來越多的基于CAR技術的細胞療法進入臨床研究階段,CAR表達部分的檢測作為藥物質控的關鍵環節,將直接影響治療效果,相關法規更是對CAR陽性率的檢測提出了明確要求。因此,為了確保從早研階段的CAR細胞制備和功能測試、CMC階段的細胞質量和純度評估、臨床測試階段的細胞體內監測和PK研究等各個環節都能嚴格把控,開發準確、簡便、通用的CAR陽性率檢測試劑顯得尤為重要。

現有的CAR的檢測方法比較

常見的CAR檢測方法包括針對人/小鼠IgG F(ab')2片段的多克隆抗體、抗獨特型抗體、Protein L等,雖然各有優勢,但也存在一些局限性,如需要針對每個CAR設計特異性抗體,成本較高,只能用于檢測已知抗原等*。

檢測方法 檢測機制 優勢 劣勢
Anti-human F(ab')2 pAb 和Anti-mouse F(ab')2 pAb 結合IgG F(ab')2 片段
  • 成本低、易于獲取、穩定性高;
  • 具備一定的通用性,可檢測不同CAR。
  • 特異性低,可能與其他 IgG-like 物質發生交叉反應;
  • 批間差難保持一致,其檢測結果受批次影響。
Anti-idiotypic antibodies 特異性結合scFv
抗原識別區
  • 特異性高,針對 CAR 的獨特抗原結合區域;
  • 靈敏度高、背景噪聲低。
  • 成本高,一般需要定制;
  • 需要針對不同 CAR 設計不同的抗體,通用性較差。
rh-protein 特異性結合scFv
抗原識別區
  • 特異性高,針對 CAR 的獨特抗原結合區域;
  • 靈敏度高、背景噪聲低。
  • 成本高,需要購買和驗證特定抗原的 rh-protein;
  • 只能用于檢測已知抗原,通用性較差。
Protein L 結合抗體K輕鏈
  • 成本低,具有一定的通用性,可檢測不同靶點的CAR。
  • 特異性較差、靈敏度較低,容易產生假陽性結果。
本司產品
Linker-specific mAbs
檢測CAR連接子
  • 特異性高,針對 CAR 的連接子序列;
  • 可用于檢測大多數 CAR;
  • 成本低、操作簡便。
  • CAR結構中需要包括連接子序列。

*Linker-specific monoclonal antibodies present a simple and reliable detection method for scFv-based CAR NK cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2024.

華美生物的linker-specific mAb產品

由于目前大多數CAR的構建體都含有Whitlow或G4S linker的單鏈可變片段(scFv),Whitlow (GSTSGSGKPGSGEGSTKG)linker主要用于針對血液惡性腫瘤的CAR構建,如CD19 CAR [1],而G4S(glycine4-serine)linker 則常用于針對實體瘤抗原的CAR,如HER2和CEA [2],若針對這兩種linker開發特異性單克隆抗體則可以檢測廣泛的CAR。基于此技術背景,華美生物現全新推出一組高效、通用性強的CAR陽性率檢測工具--抗Whitlow Linker抗體和抗G4S Linker抗體。

● 產品列表

產品名稱 產品貨號 克隆號
Whitlow linker Monoclonal Antibody CSB-MA234468A0m 18A3G5
G4S linker Monoclonal Antibody CSB-MA186062I1m 11A12E7
G4S linker Monoclonal Antibody CSB-MA186062I2m 12F11C10
G4S linker Monoclonal Antibody CSB-MA186062I3m 14A10E7

● 產品優勢

特異性高
  • 針對連接子特異性結合:特異性識別連接子序列,避免了與CAR其他區域的非特異性結合。
  • 避免假陽性:由于linker-specific mAbs不與血清中的IgG或其他蛋白質結合,因此不會產生假陽性結果。
通用性強
  • 適用于大多數CAR: 大多數CAR都包含Whitlow或G4S 連接子,具有很強的通用性。
  • 不受抗原特異性限制:不針對特定的抗原結合區域,可以檢測不同抗原的CAR。
操作簡便
  • 直接用于流式細胞術:無需復雜的實驗步驟,操作簡便,易于標準化。
  • 兼容其他方法: 可以與其他檢測方法(如rh-proteins)結合使用,提高檢測的特異性和敏感性。

● 產品數據

The Binding Activity of Whitlow linker with Anti-Whitlow linker antibody.
(貨號: CSB-MA234468A0m
CSB-MA234468A0m FC

Untransfected HEK-293F cells (green line) and transfected scFv-based Anti-CD19 CAR containing a Whitlow/218 linker stable cells (red line) were stained with anti-Whitlow linker antibody (2μg/1*106), washed and then followed by FITC-conjugated anti-Mouse IgG Fc antibody and analyzed with flow cytometry.

The Binding Activity of Whitlow linker with Anti-Whitlow linker antibody.
(貨號: CSB-MA234468A0m
CSB-MA234468A0m ELISA

Immobilized scFv-based Anti-CD19 CAR recombinant antibody at 2 μg/mL can bind Anti-Whitlow linker antibody. The EC50 is 5.147 to 5.761 ng/mL.

The Binding Activity of G4S linker with Anti-G4S linker antibody.
(貨號: CSB-MA186062I1m
CSB-MA186062I1m FC

Untransfected HEK-293F cells (green line) and transfected scFv-based Anti-CD19 CAR containing a G4S linker stable cells (red line) were stained with anti-G4S linker antibody (2μg/1*106), washed and then followed by APC-conjugated anti-Mouse IgG Fc antibody and analyzed with flow cytometry.

The Binding Activity of G4S linker with Anti-G4S linker antibody.
(貨號: CSB-MA186062I2m
CSB-MA186062I2m ELISA

Immobilized Three recombinant proteins containing G4S linker at 2 μg/mL can bind Anti-G4S linker antibody. The EC50 is 10.03 to 17.44 ng/mL, 22.60 to 28.76 ng/mL and 6.478 to 10.27 ng/mL.

參考文獻:

[1] B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 2012.

[2] CAR-T cell potency: from structural elements to vector backbone components. Biomark Res. 2022.



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