1. 特異性的選擇

特異性的選擇主要需要考慮四個方面：蛋白質的特異性、物種的特異性、實驗方法的特異性以及標記的特異性。

1.1 蛋白質的特異性

什么是蛋白質的特異性？一般來說，蛋白質的特異性指的是蛋白質結合位點與特定配體結合的能力。一個蛋白質-配體的例子就是抗體-抗原系統，它們之間的結合活性可以被描述為高度特異。了解了蛋白質的特異性后，理解抗體的特異性將更加容易。每個單個抗體蛋白都能夠通過其Y形狀抗體蛋白的可變區頂端的獨特抗原結合位點，與抗原上的一個唯一表位特異結合。這種特異性能夠精確檢測目標抗原。

常數區域在一個給定類型的所有抗體中都是相同的，選擇抗體時根據檢測的蛋白質，需要了解以下細節：

a. 如果重組蛋白并不完整表達，需要確認抗原結合位點是否位于重組蛋白的序列范圍內。

b. 對于內源性蛋白質，最好了解它們的剪接和修飾情況。對于具有特殊表型的蛋白質，需要通過比較免疫原序列和感興趣的蛋白質序列進行序列比對，以檢查物種的交叉反應性。

c. 檢測磷酸化蛋白質需要確定特定的磷酸化位點。不同的磷酸化位點意味著可能存在不同的機制，不能一概而論。

1.2 物種特異性

同源蛋白在不同物種之間存在更多或更少的變異。

a. 大多數商業抗體是使用源自人類蛋白質序列的重組蛋白或肽段制備的，因此它們可能基于序列同源性與其他物種發生交叉反應。您需要查看抗體數據表中標明的物種反應性。

b. 對于一些稀有物種，很難找到適用的抗體。在這種情況下，您應該通過序列比對選擇使用同源序列產生的抗體，但通常制造商不會接受關于質量的投訴。如果您能從供應商處獲得免費的抗體樣品，將更容易選擇到合適的抗體。

1.3 實驗方法的特異性

許多實驗需要使用抗體。在不同的方法中，由于樣品制備和目標蛋白含量的差異，對于表位和抗體效價有不同的要求。

1.4 標記的特異性

常見的實驗，如WB和IHC，通常不需要標記的一抗，而是使用標記的二抗。然而，某些基于儀器分析的實驗可能會使用標記的一抗，例如流式細胞術（FC）。在這種情況下，需要了解所使用儀器可以檢測的熒光光譜，并根據不同的參數要求選擇合適的標記。在免疫熒光雙標記實驗中，應選擇和匹配不同的熒光標記。

2. 抗體的選擇取決于實驗/應用

2.1 如何選擇WB抗體?

許多人建議使用單克隆抗體作為WB的一抗。目前，多克隆抗體生產技術與單克隆抗體生產技術一樣成熟。因此，許多多克隆抗體在WB中也表現良好。除了一抗和二抗外，WB還涉及到負載控制抗體的使用，這有助于確認整個凝膠中的蛋白質負載是相同的。加載控制通常是在你所研究的細胞類型中高水平表達的蛋白質。最后但并非最不重要的是，無論你做什么實驗，建議參考相關文獻來選擇合適的抗體。

2.2 如何選擇適用于IP/ChIP的抗體？

在免疫共沉淀（IP）中，抗體與目標蛋白的自然形式結合。因此，適用于IP的最佳抗體是使用純化的自然蛋白或純化的重組蛋白制備的抗體。最好不要使用使用合成肽制備的抗體，因為這種抗體識別的區域可能深藏在目標蛋白的內部。

免疫沉淀（ChIP）與IP之間沒有太大區別。唯一的問題是，如果抗體識別的目標蛋白區域與結合到DNA的目標蛋白區域相同，實驗可能會失敗。

2.3 如何選擇適用于IF/IHC的抗體？

在免疫熒光（IF）/免疫組化（IHC）中，有一個重要的步驟叫做固定，用于保留細胞和亞細胞結構。固定會使蛋白質變性和固定，意味著這些蛋白質與其自然形式不同，但也不同于在免疫印跡（WB）中看到的線性結構。因此，對于IF/IHC，首選的抗體是使用純化的重組蛋白或使用蛋白質表面的合成肽制備的抗體。

2.4 如何選擇適用于FC的抗體？

流式細胞術（FC）可以分為活細胞FC和固定細胞FC兩種類型。對于活細胞FC，最好選擇使用自然蛋白或重組蛋白制備的抗體；對于固定細胞FC，使用的抗體與IF/IHC中使用的抗體相同。在FC中，有直接標記和間接標記兩種方法。間接標記相對于直接標記來說準確性較低。因此，在進行FC時，最好選擇帶有熒光標記的抗體；如果沒有針對目標蛋白的標記抗體，則可以選擇間接標記，其中需要使用帶有熒光染料的二抗。

3. 主抗體和二抗的選擇

3.1 如何選擇一抗？

a. 確認抗體的名稱。全名、縮寫、替代名稱、亞型等細節都需要考慮。

b. 確認實驗/應用的類型。ELISA、WB、IHC、ICC、FACS或其他？一般來說，抗體的產品說明書會列出該抗體在哪些應用中經過驗證。如果抗體的產品說明書沒有提及特定的應用，這并不意味著該抗體不適用于該應用，只是表示該抗體在該應用中沒有經過驗證。但一般而言，最好根據產品說明書中列出的驗證信息選擇合適的抗體。

c. 確認樣本的物種。人類、小鼠、大鼠、綿羊、魚類還是山羊？一般來說，抗體的產品說明書會包含物種反應性的信息。有了這些信息，你可以確定該抗體是否適用于你的實驗。

d. 目標蛋白的結構特性。了解目標蛋白的結構特性將有助于你選擇合適的抗體。這些結構信息包括目標蛋白的結構域、樣本制備過程中蛋白質是否變性、蛋白質構象的變化以及可能影響免疫親和反應的其他因素。

e. 單克隆抗體和多克隆抗體的選擇。市場上以多克隆抗體為主導。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有更高的特異性但親和力較低，從而導致相對較低的抗原檢測靈敏度。多克隆抗體具有較低的特異性但較高的親和力，因此其靈敏度更高。使用多克隆抗體可能會增加非特異性染色的風險，可以通過阻斷或其他步驟來避免這種情況。

3.2 如何選擇二抗?

a. 種類或來源。根據一抗的種類選擇二抗。例如，如果在小鼠體內培養一抗，二抗就會對小鼠抗體產生反應。

b. 標簽的選擇。有不同的標簽，如HRP，生物素和熒光素。SP三步法一般采用生物素標記的二抗與SP反應，熒光素染色采用羅丹明、FITC、Cy3等不同熒光素標記的二抗體。

4. 常見問題解答

當您購買抗體時，抗體供應商/制造商通常會提供額外的技術支持，這非常重要。在過去，購買了我們公司Cusabio的抗體的一些客戶尋求了技術支持。以下是一些最常見的問題。

4.1 FC抗體與IHC抗體相同嗎?

它們不一定是相同的抗體。對于FC，有直接標記和間接標記。對于直接標記，抗體通常是FITC, TRITC或pe標記。如果你碰巧做免疫組化并且想要使用熒光素標記的抗體直接標記，那么你可以使用相同的抗體。如果你想在免疫組化中使用其他標記或間接標記，可能會遇到麻煩，因為熒光素標記可能會影響二抗與一抗的結合。

4.2 為什么我的抗體在WB中表現很好，但在其他實驗如IF和IHC中卻不起作用?

首先，恭喜你有一個良好的抗體。畢竟，要獲得好的抗體并不容易。其次，你的抗體可能是用合成肽產生的。如上所述，你的抗體識別的抗原肽可能恰好隱藏在目標蛋白的中心，所以你的抗體只能識別WB中的線性蛋白。

4.3 如何選擇用于免疫組織化學（IHC）的抗體？

首先，需要決定選擇單克隆抗體還是多克隆抗體。單克隆抗體和多克隆抗體的區別已經在前面總結過。如果您的實驗需要高特異性，單克隆抗體可能是更好的選擇。如果陽性信號較弱，可以嘗試多克隆抗體。多克隆抗體通常是從兔子中獲得的，而單克隆抗體通常是從小鼠中獲得的。當然，還有其他動物提供的抗體。

其次，了解主抗體可以與哪些物種反應很重要。這些信息通常在抗體產品說明書中說明。

第三，您應該注意主抗體的來源。例如，當您在人類癌組織中進行IHC檢測p53，并使用小鼠產生的抗-p53抗體作為主抗體時，您必須選擇抗小鼠的二抗，如山羊抗小鼠抗體和兔抗小鼠抗體。總之，主抗體和二抗應匹配。

最后，抗體產品說明書通常包含抗體適用的應用程序信息。如果說明書指出該抗體不能用于IHC，不要選擇它。即使說明書強調該抗體可用于IHC，也有一些情況下該抗體在IHC中效果不佳。自行驗證抗體可以幫助您獲得成功的實驗結果。

4.4 WB次級抗體和IF次級抗體相同嗎？

顯然不相同！IF次級抗體用于免疫熒光試驗，并且標記有FITC、PE或其他能夠被紫外光激活的標記物，信號通過熒光顯微鏡檢測。WB次級抗體通常標記有HRP、堿性磷酸酶或其他能與顯色底物（如OPD\TMB）反應的分子，結果可以直接用肉眼觀察或通過化學發光儀器檢測。

4.5 ChIP抗體能在WB中使用嗎？

不一定。一般來說，ChIP抗體對純度、特異性和其他參數有更高的要求。因此，ChIP抗體通常可以在WB中使用。然而，ChIP抗體識別的是構象性抗原表位，而不是線性表位。這種類型的ChIP抗體不能在WB中使用。

4.6 如果抗體產品說明書中沒有提及特定的應用程序怎么辦？

通常，抗體會在WB、IP、IF和IHC中進行驗證。因此，最好不要將抗體用于未在抗體產品說明書中提及的實驗。

4.7 ELISA抗體可以用于WB嗎？

對于WB，抗體的稀釋倍數通常為1:1000；對于IF/IHC，為1:100；對于ELISA，為1:10000。如果一個抗體用于ELISA，通常意味著抗體效價不高。這并不意味著所有用于ELISA的抗體都不能用于WB。如果抗體產品說明書上說明ELISA的稀釋倍數為1:1000，那么可以嘗試1:100的稀釋倍數進行WB實驗。