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Science:準(zhǔn)確定位5hmC的新方法

日期:2012-05-03 08:09:29

作為第六種堿基,5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)近年來受到了廣泛的關(guān)注。盡管這種堿基的確切功能仍在研究中,但普遍認(rèn)為它參與了DNA去甲基化或基因表達(dá)調(diào)控。若要了解5-hmC的生物學(xué)功能,研究人員必須清楚它在基因組中的位置。為此,劍橋大學(xué)和Babraham研究所的研究人員開發(fā)出一種新技術(shù),能定位基因組中單個位點(diǎn)上的5mC5hmC。該成果于426日發(fā)表在《Science》在線版上。

 

5-hmC5-mC的羥基化形式,1952年在噬菌體DNA中首次發(fā)現(xiàn)。幾十年來,羥甲基胞嘧啶的研究一直圍繞著它對于噬菌體DNA的保護(hù)作用。直至近兩年,研究人員才發(fā)現(xiàn)它在人和小鼠大腦以及胚胎干細(xì)胞中廣泛存在,可通過TET家族的酶對5-mC的氧化而產(chǎn)生。5hmC5mC的關(guān)系可能影響了干細(xì)胞的分化和發(fā)育。鑒于這一重要性,確定5hmC在基因組中的定位可能對癌癥、神經(jīng)生物學(xué)以及生物學(xué)的其他方面有著非同尋常的意義。

 

亞硫酸氫鹽測序是發(fā)現(xiàn)基因組中5mC的標(biāo)準(zhǔn)方法,但它無法區(qū)分5mC5hmC。因此,劍橋的化學(xué)家Shankar Balasubramanian及其同事在尋找一些化學(xué)反應(yīng),希望能改變其中一個核苷酸,讓它們在測序中以不同的形式讀取。

 

他們采用的新方法在5hmC上添加了一個氧原子,這導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化成另一個修飾的核苷酸,5-甲氧基胞嘧啶(5fC)。在進(jìn)入亞硫酸氫鹽的測序步驟時,這種新的核苷酸轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。而額外的氧化步驟對5mC無影響,這樣研究人員就能區(qū)分基因組中這兩種核苷酸。

 

為了檢驗(yàn)氧化反應(yīng)是否只針對5hmC,研究人員將三條合成的雙鏈DNA(包含胞嘧啶C、5mC5hmC)暴露在高釕酸鉀(KRuO4)中,之后開展亞硫酸氫鹽測序。實(shí)驗(yàn)表明,5mC和胞嘧啶未轉(zhuǎn)化成尿嘧啶,而5hmC確實(shí)轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。

 

之后,研究小組利用氧化過程來靶定小鼠胚胎干細(xì)胞的基因組DNA中的5hmC。利用氧化和亞硫酸氫鹽測序過程,他們高度精確地定位了5hmC。將此結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)亞硫酸氫鹽測序的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,研究人員確定了5hmC5mC的精確位置。

 

Balasubramanian認(rèn)為:“這是首個以單堿基分辨率對5hmC5mC進(jìn)行定量測序的方法。此方法相當(dāng)簡單,操作簡便,并與所有測序平臺兼容。倘若是全基因組測序,主要的成本仍然是測序?!?/SPAN>

 

去年,美國芝加哥大學(xué)與Pacific Biosciences公司的研究人員合作,曾利用第三代單分子測序技術(shù)和5-hmC的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來高通量檢測5-hmC。借助PacBio RS測序儀,研究人員可直接檢測DNA甲基化,包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC5-hmC

 

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