六、經修飾的單克隆抗體

為了提高單克隆抗體在治療和體內診斷中的作用，常用單抗與毒素、藥物、放射性核素或其它物質偶連形成免疫結合物，或在同一段多胎鏈包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重組蛋白來獲得。研究者除對前面提到的有關未偶連單克隆 抗體（未修飾單克隆 抗體）的要求外，還應提供下列內容：

（一）免疫結合物的構建

應提供構建免疫結合物所用試劑和過程的詳細資料，包括：

1、描述與單克隆抗體連接的成分如：毒素、藥物、酶及細胞因子，包括：所有成分的來源、結構、制法、純度及特征。

2、制備免疫結合物所用化學試劑的描述，如連接劑和螯合劑。這些資料應該包括試劑來源、制備方法，以及合成或純化時殘留雜質的測定等內容。還應提供合成反應途徑的圖解，以及與免疫結合物中所用化學試劑毒性相關資料。

3、在確定成品的標準時應首先確定該原料與抗體的平均結合率及每個抗體被結合部分的數量，并揭示免疫球蛋白置換數量、效力和穩定性間的關系。

4、用重組DNA技術制備的制品（如來源于轉染細胞系或微生物培養基，嵌合的、易形的，互補決定區［CDR］接合的及單鏈Fv抗體，以及重組免疫結合物）應提供構建和置備過程的全部資料。重組免疫結合物的穩定性應認真研究。因聚合物形成構形改變或變性而減弱了特異免疫反應性（如通過重組Fvs形成"雙抗"）可能導致藥代動力學的改變和/或與非靶組織結合。

（二）免疫結合物的純度

1、應采取特殊措施保證抗體盡可能無外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因這些污染物質在構建免疫結合物過程中，能與核素、毒素或藥物發生反應。

2、應規定最終產品中游離抗體或游離組分的限量。活性中間體應被滅活或去除。

（三）免疫結合物的免疫反應性，效力及穩定性

毒素或藥物偶聯至抗體上會改變其中任一成分的活性。

1、應采用適當的方法；評估偶聯前后的免疫反應性。

2、免疫結合物非免疫球蛋白成分的活性應在適當的時候用效力試驗來進行評估（例如，毒素、細胞因子或酶等），用于造影的放射性免疫結合物除外。

3、免疫結合物構建后，應確定免疫反應性變化的百分率限值，并作為產品規格的組成部分。

4、應通過在合并的人血清中37℃無菌條件下孵育，來檢測免疫結合物在體外的穩定性。假如所用抗凝劑不會影響免疫結合物的穩定性，血漿可以用來代替血清。經過規定間隔時間分析樣品中完整免疫結合物及分解產物的濃度。應詳細說明評估產品的穩定性的條件及所用陰、陽對照。

（四）與放射性核素偶聯單克隆抗體的特殊問題

放免結合物應用標準化的、嚴格控制并經過驗證的方法制備。應建立檢測游離同位素、結合單克隆抗體、標記的非免疫球蛋白物質的放射性百分率的方法。

1、放射性標記單克隆抗體的初始研究用新藥申報包含連續3次放射標記試生產的分析結果，應證明所制備的產品未改變免疫特異性、無菌、無熱原質。放射性標記試生產應由在研究中對單克隆 抗體進行放射性標記及使用試劑的同一組人員進行。

2、制備免疫結合物時應使用放射性藥品及同位素并應提供其無菌及無熱原質的分析證書及橫向參比的信涵。

3、在標記試生產過程中，應測定最終產品中共價結合的和游離的同位素的濃度，以及標記試劑及其分解產物的殘留水平。

4、應描述給每一個病人應用前后進行的質控試驗。

5、適當的時候，應檢測免疫結合物形成膠體的情況，并對其進行限定。

6、有關單抗制備中放射性標記物的質控標準參考國家關于放射性藥品規定。

七、產品穩定性

產品穩定性應滿足臨床方案制定的要求。加速穩定性試驗資料可作為產品審批及標定用，但不能代替實際的穩定性資料。

（一）應制定穩定性檢定規劃，包括在規定效期全過程中，每間隔一定時間進行制品的物理化學完整性試驗（如斷裂或聚合），效力試驗，無菌試驗，以及水分、pH和防腐劑的穩定性測定。

（二）確保制品生物活性的穩定性試驗（例如定量體外效率試驗）應包括廠內參比品。如可能在試驗的全過程中只使用一批試驗抗原（如：純化的抗原、細胞或組織）。應用定量效力試驗使對生物活性進行有意義的比較成為可能。

（三）加速穩定性試驗，既將制品儲存在溫度高于常規儲存溫度后的穩定性試驗，可能有助于鑒定及建立穩定性指示試驗。表示穩定性的特定參數應通過對每一批制品用趨向分析方法進行監測。

八、臨床前研究

由于生產條件或配方的改變可引起制品生物活性的明顯變化。因此，建議在臨床前研究中所使用的單抗應與臨床試驗中擬使用的單抗的生產工藝一致。

（一）交叉反應性試驗

當相同或相關抗原決定簇在人的非預定的細胞或靶組織表達時，可觀察到抗體與它們結合。非靶組織結合可能具有嚴重后果，特別是使用藥理活性抗體或細胞毒性免疫結合物時。因此，一般在Ⅰ期臨床試驗前應經過用人組織或細胞進行交叉反應性或非靶組織結合的實驗室檢測。對于雙特異性抗體，除檢測雙特異性產品外，還應對每株親本抗體進行逐個評估。

1、檢測交叉反應性的體外試驗

目前，用人細胞或組織進行免疫細胞化學及免疫組織化學技術檢測，應使用有效的并被確認的新技術（參照1、2、4）。

2、測定交叉反應性的體內試驗

當有適當模型時，單克隆抗體與非靶人組織的交叉反應性應在動物中進行一次綜合的體內試驗。試驗結果，特別是對具有溶細胞性的免疫結合物或具有ADCC活性的抗體，通常要求進行更廣泛的臨床前試驗，包括用一種以上動物超劑量及重復劑量進行動物試驗。設計臨床試驗時應考慮對非靶組織的定位。

（二）臨床前藥理學和毒性試驗

1、設計單克隆抗體臨床前安全試驗是為了預測在人體中可能的毒性

評估在人體中潛在不良反應副作用的可能性和嚴重程度，并可能確定安全初始劑量和逐步提高劑量。有關單克隆抗體的臨床前試驗，包括免疫原性、穩定性、組織交叉反應性和效應功能。

2、動物毒理學研究

當設計單克隆抗體的毒理學試驗時，應考慮如下：

（1）若被試樣品為未偶聯抗體，且無合適的動物模型或無攜帶相關抗原的動物，且與人組織交叉反應性試驗明顯陰性，則毒理學試驗不是必須的。

（2）動物體內相關抗原的性質與人體內相關抗原的生物學分布、功能及結構應具有可比性。但是，對于所用的動物模型，不必要求對單克隆 抗體的抗原密度或親和力絕對相等。例如，結合力差異可通過增加劑量或服藥頻率來彌補。應鑒定動物和人之間存在的抗原數，單克隆 抗體的抗原親和力或對單克隆 抗體結合的細胞應答反應等方面存在的差異。這可以更精確的推斷人用的安全初始劑量,并評估安全范圍。

（3）對單克隆抗體通常不要求進行常規誘變性的評估。

（4）擬給育齡婦女反復或長期使用的產品，應該用適當的動物模型進行反復的深入的研究包括致畸試驗。

3、藥效學和動物藥代動力學

（1）當有動物模型時，則應盡可能證明藥理學效應與劑量的依賴性，以及有效劑量的范圍，可以更好地預測治療指數；當無適合動物模型時，則應盡可能以人外周血、組織器官等進行體外藥效學研究。當有動物模型時，藥代動力學的有關資料（生物學分布，半衰期等）可以從動物模型中得到；當無適合動物模型時，動物藥代動力學可以考慮不做，加強臨床試驗時藥代動力學方面的監控。

（2）下列方面可以指導藥代動力學幾藥效學試驗動物種類的選擇：

①最好選擇與人有交叉反應或相同靶抗原的動物模型來進行試驗。對于僅抗人而未在動物模型中表達的人抗原或外源抗原（細菌，病毒等）的未偶聯單克隆抗體，可以不必用缺乏靶抗原的動物做試驗。

②當有抗原結合資料表明靈長類為最相關種屬時，則對未偶聯的單克隆抗體的試驗采用非人靈長類動物是適宜的。

③應對使用正常嚙齒類動物和鼠異源移植模型精確預測單克隆抗體在人體的藥代動力學行為的可能性進行嚴格評估。異源移植模型對評估單克隆 抗體與人體內腫瘤結合的能力更有意義。

（3）鼠源抗體對于小鼠為非免疫原性物質，但在人體內具免疫原性，這就使得在鼠內所得的重復劑量結果難以推至擬在人體內使用的重復劑量。使用完全人源的、嵌合的或"人源化的"單克隆 抗體將出現相應的問題，在這種情況下用嚙齒類動物進行重復劑量的研究意義不大。

4、用免疫結合物進行的臨床體內研究

（1）應在體內試驗免疫結合物的穩定性

①應測定免疫結合物中每個組分在動物體內藥代動力學和組織分布，并且與未偶聯抗體的分布相比較。

②不同組分的靶組織和他們能引起的潛在的毒性應被證實。

（2

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