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限制性內(nèi)切酶質(zhì)量控制(Restriction Endonucleases: Quality Control)

日期:2011-08-26 09:53:51

單位定義

限制性內(nèi)切酶的一個活性單位是指,在50μl 的反應(yīng)體系里,采用隨酶提供的 NEBuffer,用1個小時的時間,徹底消化1μg底物DNA所需要的酶量。 酶切反應(yīng)應(yīng)在帶蓋的Eppendorf 管中進(jìn)行,選用技術(shù)數(shù)據(jù)卡上所標(biāo)明的適宜溫度。在確定酶活性之前,濃縮的酶應(yīng)該用推薦的貯存液稀釋成大約1,000 單位/ml。

質(zhì)量控制

所有質(zhì)量控制鑒定結(jié)果都公布在隨酶提供的技術(shù)數(shù)據(jù)卡上。

非特異性內(nèi)切酶鑒定

為鑒定非特異性內(nèi)切酶污染,限制性內(nèi)切酶與缺少該酶識別序列的超螺旋DNA底物溫育。對于RF IDNA(超螺旋形式),一個單一的非特異性缺口就會將它轉(zhuǎn)變成RF IIDNA(帶缺口環(huán)狀)。小份的限制性內(nèi)切酶與1μgDNA50μl反應(yīng)體系中,采用推薦的NEBuffer,在推薦的溫度下溫育4小時。兩種形式的DNA在瓊脂糖凝膠上很容易區(qū)分,可以計算出從RF I RF II的轉(zhuǎn)化率。

核酸酶污染的過夜鑒定

所有的限制性內(nèi)切酶與1μg 底物DNA50μl反應(yīng)體系中,采用推薦的NEBuffer溫育過夜。比較酶切1小時的特征帶型和過夜酶切的帶型。如果兩種情況下帶型均明顯、沒有改變,則說明測試的酶中不存在非特異性的DNA酶。我們報道了可以溫育過夜的最大酶單位數(shù)。

核酸外切酶污染鑒定

所有的限制性內(nèi)切酶與1μg 單雙鏈混合的、3H標(biāo)記的E.coli DNA (200,000 cpm/μg)50μl反應(yīng)體系中,采用隨酶提供的NEBuffer,在推薦的溫度下溫育4小時。通過可溶解的TCA著色,可以計算出反應(yīng)體系中被標(biāo)記的DNA的百分比,進(jìn)而可以顯示出核酸外切酶的污染。該種方法可檢測出的底線是0.05%。

DNA片段的連接

DNA片段通過用每一種限制性內(nèi)切酶過量消化底物DNA而獲得。這些片段隨后用T4 DNA連接酶連接( 5′ 末端濃度為0.1-1.0 μM)。連接的片段然后用同一種限制性內(nèi)切酶重切。僅當(dāng)3′ 5′末端都保留完整,連接反應(yīng)才會發(fā)生;而且只有那些識別位點(diǎn)完全恢復(fù)的分子才能被重切。切割后正常的帶型說明3′ 5′末端都是完整的,而且準(zhǔn)備的酶樣品中檢測不到核酸外切酶和磷酸酶。采用PstI的一個例子顯示如下: 

 
 

藍(lán)白斑篩選鑒定

用于克隆的酶還須通過額外的質(zhì)量鑒定――藍(lán)白斑篩選鑒定,以確定經(jīng)酶過量消化后DNA末端的完整性。該種鑒定方法為:用酶10倍過量消化適當(dāng)?shù)妮d體上lacZ基因中單一的酶切位點(diǎn),連接,轉(zhuǎn)化,并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、連接和表達(dá)b-galactosidase可以說明克隆后基因是完整的,一個完整的基因產(chǎn)生藍(lán)斑,一個不完整的基因(例如,降解的DNA末端)產(chǎn)生白斑。在進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定中,所有的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的白斑數(shù)量不應(yīng)超過3%

 

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