CLDN3：極為關鍵的緊密連接蛋白，Claudins家族再添藥物靶點！
日期：2023-03-01 10:57:18
Claudins家族是近年發現的緊密連接蛋白的一種，其表達數量和分布結構的變化直接影響緊密連接的結構和功能。緊密連接是相鄰細胞間重要的膜連接復合體，Claudin蛋白是其主要骨架蛋白。目前已發現有近30個家族成員，根據功能的差異可將其分為兩類，如Claudin-1、Claudin-3、Claudin-4和Claudin-5；另一類則與構成特定的通道有關，如Claudin-2、Claudin-7、Claudin-10和Claudin-16等。
Claudins蛋白已成為當前腫瘤發病機制、診斷和治療研究中的熱點（Claudin家族熱門靶點文章報道CLDN4；CLDN6；CLDN9）。近年來也有不少關于Claudin-3與腫瘤相關的研究報道，這些研究均提示Claudin-3的異常表達與腫瘤的發生、發展密切有關。因此，Claudin-3有望成為Claudins家族的下一個新藥靶點！
1. 什么是緊密連接蛋白？
緊密連接蛋白由細胞質附著蛋白、跨膜蛋白和細胞骨架蛋白共同組成。緊密連接主要存在于上皮細胞、內皮細胞間的連接復合體中，使相鄰細胞膜緊靠在一起，形成環繞細胞的物理屏障結構。其中，跨膜蛋白包括以下3種完整膜蛋白：連接黏附分子（JAM）、咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudin）。目前認為，跨膜蛋白中起主要作用的是Occludin和Claudin，尤其以Claudin的作用最為重要，這是形成緊密連接功能的主要蛋白 [1]。
Claudin主要作用是維持細胞間的物理屏障功能及細胞極性。腫瘤的發生、發展及轉移是一個多因素造成的分階段過程，但是目前普遍認為細胞間的黏附力喪失可導致細胞緊密連接破壞，與腫瘤細胞的浸潤和轉移相關，這使得Claudin家族成為備受關注的治療靶點 [2]。
2. 什么是CLDN3？
緊密連接蛋白3（Claudin3/CLDN3）屬于跨膜緊密連接蛋白Claudins家族的一員。CLDN3相對分子質量20 kDa-34 kDa，是緊密連接中最重要的骨架蛋白。在結構上，Claudins由面向細胞質的N末端、C末端，2個細胞外環、4個跨膜結構域組成（圖1） [3]。其中，面向胞漿的C末端還含有由80-90個氨基酸殘基組成的PDZ結構域，它與ZO1、ZO2、ZO3和多PDZ結構域蛋白1（MUPP1）相互作用，這是緊密連接蛋白復合體與其他多種蛋白的結合位點。
CLDN3在維持細胞間物理屏障功能和參與分子細胞間傳遞方面發揮著重要作用，是參與血腦屏障、腸道屏障、血睪屏障構成的重要組成部分。CLDN3不僅在人體前列腺、胰腺細胞、肝細胞等多種腺細胞，同時還在乳腺導管上皮、子宮內膜、食管黏膜、肺泡上皮、和膽管上皮細胞等多種上皮細胞內均有表達 [4-6]。
圖1. CLDN3的結構 [3]
3. CLDN3的配體
產氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）是CLDN3第二胞外環的高親和力天然配體。這種毒素結合其受體CLDN3，形成膜孔復合物，通過細胞膜穿透作用使得細胞溶解壞死（圖2） [7-8]。CLDN3在人類CRC、食管癌、上皮性卵巢癌等癌癥組織中均呈高表達，而產氣莢膜梭狀芽孢桿菌內毒素能夠有效地抑制CLDN3表達的惡性腫瘤，這為CLDN3成為靶向治療惡性腫瘤提供了可能性 [7-8]。
除了CLDN3，產氣莢膜梭菌腸毒素也是CLDN4蛋白的一種天然的配體。因此，CPE毒素與CLDN3和CLDN4蛋白結合可導致細胞迅速溶解 [9]。最近有研究發現，CPE以表達CLDN-3、-4蛋白的腫瘤細胞作為靶點，抑制腫瘤細胞。例如在胰腺癌細胞，CLDN-3、-4高表達，利用細胞病變效應（CPE）瘤內注射異種嫁接的胰腺癌細胞，結果引起腫瘤細胞大面積壞死，明顯延緩腫瘤生長 [10]。
圖2. CLDN3結合CPE促進細胞溶解壞死 [8]
4. CLDN3在腫瘤中的作用機制
CLDN3在維持上皮細胞極性、基因轉錄、抑制腫瘤、細胞增殖分化、新陳代謝相關的基因和炎癥免疫反應等方面有著重大的作用。CLDN3具體作用可能取決于組織的高度特異性及細胞內精確的分子信號通路。目前，CLDN3的異常表達與腫瘤之間關系的確切機制尚不完全清楚。
在肝癌中，CLDN3能夠通過下調糖原合成酶激酶GSK3B、鈣黏蛋白相關蛋白CTNNB1、鋅指家族轉錄抑制因子SNAI2和血管鈣黏蛋白CDH2的表達，使Wnt/β-catenin-EMT轉移軸失活，從而顯著抑制肝癌的轉移 [11-12]。此外，CLDN3的敲除也會降低肝臟內相關膽汁酸代謝基因（Cyp27a1、Ces1b和Akr1c6）的表達 [13]。丟失CLDN3或4可通過激活Akt磷酸化而活化PI3K通路，導致PI3K活性劑Twist轉錄因子表達水平增加，表明它們的缺失可以促進上皮間質轉化 [14]。
在肺腺癌組織中，CLDN3的表達量顯著升高，并且CLDN3的過表達與肺腺癌細胞的惡性潛能及ERK1/2和PI3K-Akt信號通路相關 [14]。在結直腸癌組織中，CLDN3在CRC組織中的水平可通過SCF/c-kit/JNK/AP-1信號轉導通路的激活可以使之升高 [15]。在卵巢癌中，CLDN3表達受到棕櫚酰轉移酶ZDHHC12調控，提示靶向ZDHHC12介導的CLDN3 S-棕櫚?；赡苁锹殉舶┲委煹臐撛诓呗?（圖3） [16]。另有研究表明，CLDN3可能通過維持E-cadherin的表達和限制β-連環蛋白(β-catenin)信號轉導，介導了與體內其他細胞的相互作用，從而抑制了生長和轉移潛能 [17]。
圖3. CLDN3表達受到棕櫚酰轉移酶ZDHHC12調控 [16]
5. CLDN3在腫瘤等疾病中的作用
CLDN3作為構成內皮細胞緊密連接的主要蛋白，當其表達發生異常時可導致內皮細胞間結構遭到損壞。緊密連接的破壞可能導致細胞黏附減弱，引起腫瘤細胞的極性丟失、生長失控乃至腫瘤侵襲和轉移。研究發現，CLDN3與多種腫瘤相關，同時在肝功能等疾病中也扮演重要角色。
5.1 CLDN3與腫瘤
在結直腸癌中，發現表皮生長因子（EGF）能增加結直腸癌細胞系HT-29細胞CLDN3表達，促進細胞遷移，同時增加了新的癌巢的形成，說明過表達的CLDN3提高結直腸癌細胞的侵襲潛能 [14]，而EGF是多種惡性腫瘤發生時增高的標志物，EGF受體拮抗劑吉非替尼等已經應用于臨床抗腫瘤治療。
在前列腺癌中，相對于前列腺增生組織，CLDN3表達上調。利用Northen印跡發現，與周圍正常組織比較，人類前列腺癌組織上皮細胞中的CLDN3基因轉錄信使RNA水平顯著增高 [18]；在鼻咽癌中，CLDN3也是如此，CLDN3在鼻咽癌組織中的表達率要高于鼻咽癌旁組織。然而，在病理分期更高的鼻咽癌組織，CLDN3的表達率更高 [19]。
在宮頸癌Hela細胞株中，生長抑素SST可以促進CLDN3和CLDN4的基因表達，從而對宮頸癌的發展和擴散有抑制作用 [20-22]。在乳腺癌中，CLDN3與BRCA1突變有關 [23]。在鱗狀上皮細胞癌中，CLDN3蛋白水平的降低與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤復發顯著相關 [24-25]；在肝癌中，CLDN3與肝癌患者的生存期顯著相關，提示可作為肝癌的一個潛在預后標志物。這些研究表明，CLDN3可能是一種重要的疾病標志物和治療靶點 [5-6]。
5.2 CLDN3與其它疾病
血腦屏障結構的破壞是導致早期腦缺血的主要病理學基礎。CLDN3與血腦屏障的結構、功能密切相關，可通過人為改變緊密連接蛋白CLDN3的表達來改變血腦屏障的通透性 [26]；膽固醇結石GSD是一種主要常見于成人的肝臟疾病，發病率隨著年齡的增長而增高，敲除CLDN3基因的小鼠肝臟中，旁細胞的屏障功能受到損壞，可加速以磷酸鈣為核心的膽固醇結石形成 [27]。事實上，CLDN3作為肝臟中表達最多的TJ蛋白，一旦CLDN3表達失調，可導致多種肝臟疾病的發生發展，如慢性肝病腸道菌群失調、慢性肝病、肝膽系統惡性腫瘤 [28]。
6. CLDN3的臨床研究前景
CLDN3是緊密連接中的一個關鍵蛋白，參與了緊密連接的選擇性滲透和細胞極化，并在細胞間傳輸物質和能量時發揮連接作用。由于具有較高的組織特異性，CLDN3已被廣泛研究，尤其在多種腫瘤的發生和發展中發揮重要作用。對CLDN3表達情況和相關調節因子進行深入研究，以尋找或設計與其特異性結合的靶向因子，干擾細胞表型，可能為CLDN3相關的疾病提供有效策略。來自Pharmsnap的數據顯示，已有一些臨床前和藥物發現階段的CLDN3相關藥物在研（表1）。目前，基于CLDN3的靶向治療正成為CLDN家族的一個重要研究方向，具有重要的藥物研發潛力！
| 藥物 | 靶點 | 作用機制 | 藥物類型 | 在研適應癥 | 在研機構 | 最高研發狀態 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ABN 501;ABN-501;Anti-CLDN3 monoclonal antibody - Abion | CLDN3 | CLDN3抑制劑 | 單克隆抗體 | 卵巢癌 | ABION, Inc. | 臨床前 |
| KM-3907;dual claudin-3/claudin-4 mAb(Kyowa Hakko Kirin) | CLDN3； CLDN1 |
CLDN3抑制劑; CLDN1抑制劑 |
雙特異性抗體 | / | / | 藥物發現 |
| MORAb-075;anti-claudin-3/4 humanized mAb(Morphotek) | CLDN3； CLDN1 |
CLDN3抑制劑; CLDN1抑制劑 |
單克隆抗體 | / | / | 藥 |
表1：CLDN3的臨床在研藥
為鼎力協助科研和藥企人員針對CLDN3在腫瘤等疾病中的臨床應用研究，CUSABIO推出CLDN3活性蛋白（Code: CSB-MP005505HU）產品，助力您在CLDN3機制方面的研究或其潛在臨床價值的探索。
Recombinant Human Claudin-3(CLDN3)-VLPs (Active)
The high specifity was validated by western blot. (Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.
Immobilized Human CLDN3 at 10μg/mL can bind Anti-CLDN3 recombinant antibody (CSB-RA005505MA1HU), the EC50 is 23.62-34.37 ng/mL.VLPs (CSB-MP3838) is negative control.
參考文獻：
[1] Fujiwara, Sachiko, et al. "Tight junction formation by a claudin mutant lacking the COOH-terminal PDZ domain-binding motif ." Annals of the New York Academy of Sciences 1516.1 (2022): 85-94.
[2] Castro Dias, Mariana, et al. "Claudin-3-deficient C57BL/6J mice display intact brain barriers." scientific reports 9.1 (2019): 203.
[3] Che, J., Yue, D., et al. "Claudin-3 Inhibits Lung Squamous Cell Carcinoma Cell Epithelial-mesenchymal Transition and Invasion via Suppression of the Wnt/β-Catenin Signaling Pathway." International Journal of Medical Sciences, 15(4) (2018): 339-351.
[4] Lei, Ningjing, et al. "Claudin-3 inhibits tumor-induced lymphangiogenesis via regulating the PI3K signaling pathway in lymphatic endothelial cells. " Scientific Reports 12.1 (2022): 17440.
[5] Wang, ZhaoHan, et al. "Plasma claudin-3 is associated with tumor necrosis factor-alpha-induced intestinal endotoxemia in liver disease." Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology 43.4 (2019): 410-416.
[6] Yang, Y., et al. "Mo1775 Epigenetic Inactivation of Claudin 3 in Hepatocellular Carcinoma and Its Functional Consequences." Gastroenterology 5.144 ( 2013): S-1023.
[7] Torres, Julia Bagu?a, et al. "Radiolabeled cCPE peptides for SPECT imaging of claudin-4 overexpression in pancreatic cancer." journal of Nuclear Medicine 61.12 (2020): 1756-1763.
[8] La Charité-Harbec, Simon, et al. "Claudin-3 regulates luminal fluid accumulation in the developing chick lung." Differentiation 124 (2022): 52-59.
[9] Li, Xiangru, et al. "Development of an Anti-Claudin-3 and -4 Bispecific Monoclonal Antibody for Cancer Diagnosis and Therapy." journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 351.1 (2014): 206-213.
[10] Pahle, Jessica, et al. "Effective oncoleaking treatment of pancreatic cancer by claudin-targeted suicide gene therapy with Clostridium perfringens enterotoxin (CPE)." Cancers 13.17 (2021): 4393.
[11] Gasperoni, Jemma G., et al. "Grainyhead-like (Grhl) target genes in development and cancer." International Journal of Molecular Sciences 23.5 (2022): 2735.
[12] Ahmad, Rizwan, et al. "Loss of claudin-3 expression induces IL6/gp130/Stat3 signaling to promote colon cancer malignancy by hyperactivating Wnt/β- catenin signaling." Oncogene 36.47 (2017): 6592-6604.
[13] Reiling, Janske, et al. "Low-Dose Lipopolysaccharide Causes Biliary Injury by Blood Biliary Barrier Impairment in a Rat Hepatic Ischemia /Reperfusion Model." Liver Transplantation 23.2 (2017): 194-206.
[14] de Souza, Waldemir F., et al. "Claudin-3 overexpression increases the malignant potential of colorectal cancer cells: roles of ERK1/2 and PI3K-Akt as modulators of EGFR signaling." ploS one 8.9 (2013): e74994.
[15] Wang, Yaxi, et al. "SCF/C-Kit/JNK/AP-1 signaling pathway promotes claudin-3 expression in colonic epithelium and colorectal carcinoma." International journal of molecular sciences 18.4 (2017): 765.
[16] Yuan, Meng, et al. "ZDHHC12-mediated claudin-3 S-palmitoylation determines ovarian cancer progression." Acta Pharmaceutica Sinica B 10.8 (2020): 1426-1439.
[17] Che, Juanjuan, et al. "Decreased expression of claudin-3 is associated with a poor prognosis and EMT in completely resected squamous cell lung carcinoma ." Tumor Biology 36 (2015): 6559-6568.
[18] Orea, María J., et al. "Claudin-3 Loss of Expression Is a Prognostic Marker in Castration-Resistant Prostate Cancer." International Journal of Molecular Sciences 24.1 (2023): 803.
[19] Tessier-Cloutier, Basile, et al. "Proteomic analysis of transitional cell carcinoma-like variant of tubo-ovarian high-grade serous carcinoma." Human pathology 101 (2020): 40-52.
[20] Chen, Peng, et al. "Structural basis for CSPG4 as a receptor for TcdB and a therapeutic target in Clostridioides difficile infection." Nature communications 12.1 (2021): 3748.
[21] Xie, Xiaoxi, et al. "Roles of gastrointestinal polypeptides in intestinal barrier regulation." Peptides (2022): 170753.
[22] Liu, Jinhui, et al. "Development of an immune gene prognostic classifier for survival prediction and response to immunocheckpoint inhibitor therapy/ chemotherapy in endometrial cancer." International immunopharmacology 86 (2020): 106735.
[23] Szade, Jolanta, et al. "Comparison of claudin-3 and claudin-4 expression in bilateral and unilateral breast cancer." Neoplasma 68.2 (2020): 283-289.
[24] Feng, Ji, et al. "Capsaicin inhibits migration and invasion via inhibiting epithelial-mesenchymal transition in esophageal squamous cell carcinoma by up-regulation of claudin-3 expression." Journal of Functional Foods 89 (2022): 104934.
[25] Che, Juanjuan, et al. "Claudin-3 inhibits lung squamous cell carcinoma cell epithelial-mesenchymal transition and invasion via suppression of the Wnt /β-catenin signaling pathway." international journal of medical sciences 15.4 (2018): 339.
[26] Haseloff, Reiner F., et al. "Transmembrane proteins of the tight junctions at the blood-brain barrier: structural and functional aspects ." Seminars in cell & developmental biology. vol. 38. Academic Press, 2015.
[27] Tanaka, Hiroo, et al. "Claudin-3 regulates bile canalicular paracellular barrier and cholesterol gallstone core formation in mice." journal of hepatology 69.6 (2018): 1308-1316.
[28] Baier, Felix Alexander, et al. "Loss of Claudin-3 Impairs Hepatic Metabolism, Biliary Barrier Function, and Cell Proliferation in the Murine Liver." Cellular and molecular gastroenterology and hepatology 12.2 (2021): 745-767.
