內(nèi)參即內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。

       

       在Western Blot實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

       此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

     

      常用的細(xì)胞總蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH和細(xì)胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。對于一些植物的樣本，則需要特別的植物Actin蛋白作為內(nèi)參。當(dāng)實(shí)驗(yàn)樣品中只是核蛋白，而不是細(xì)胞總蛋白提取液時，可以用組蛋白H（Histone H），或者增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）等為核內(nèi)參抗體。而在一些特別的針對線粒體作為微環(huán)境的研究課題時，則需要提取線粒體總蛋白并檢測其中的目標(biāo)蛋白含量，常用COX IV或VDAC1作為內(nèi)參抗體。

       在選擇內(nèi)參時，需要綜合考慮待檢蛋白的分子量大小以及在細(xì)胞中的位置，內(nèi)參與檢測的目的蛋白的分子量應(yīng)相差5kDa以上。

 

 

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，由4個30-40kDa的亞基組成，分子量146kDa，檢測條帶大約在36kDa。 GAPDH基因幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，可廣泛用作Western Blot蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。

※不適合用于檢測30kDa-40kDa大小目標(biāo)蛋白的WB實(shí)驗(yàn)中。在某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，也不適合做內(nèi)參。

 

 

Actin即肌動蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。Actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作為內(nèi)參是得到了公認(rèn)的，這是針對大多數(shù)組織和細(xì)胞來說的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達(dá)量非常豐富，其含量占所有細(xì)胞總蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情況下，如脂肪組織或細(xì)胞內(nèi)，β-Actin的表達(dá)量就很少。β-actin由375個氨基酸組成，分子量大小為42-43kDa左右。

※適合用于檢測38kDa-48kDa大小目標(biāo)蛋白的WB實(shí)驗(yàn)中。在脂肪組織里，β-Actin的表達(dá)量非常低，不適合作為內(nèi)參。

 

 

Tubulin即微管蛋白，是細(xì)胞的一種骨架蛋白。Tubulin分為α、β、γ、δ、ε等多種tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成異源二聚體，是形成微管的最主要的兩種Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分別為55kDa和50kDa，其實(shí)際檢測條帶均在55kDa左右。作為內(nèi)參，β-tubulin的蛋白水平通常不會發(fā)生改變，因此被廣泛用于Western Blotting時上樣量是否一致的參照，也常被用于免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)。

※不適合用于檢測50kDa-60kDa大小目標(biāo)蛋白的WB實(shí)驗(yàn)中。在脂肪組織或細(xì)胞內(nèi)，β-Actin的表達(dá)量很少，不適合做內(nèi)參。

 

 

 

★在做多組織多細(xì)胞樣本對比表達(dá)量時，最好選用GAPDH作為內(nèi)參，因?yàn)镚APDH是代謝類蛋白，在活組織中表達(dá)比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會有差異性。

★做誘導(dǎo)后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時，應(yīng)選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如β-Actin 和β-Tubulin。

★設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時候應(yīng)該考慮實(shí)際的實(shí)驗(yàn)因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中也應(yīng)該注意內(nèi)參表達(dá)是否出現(xiàn)異常。

★做 Western Blot實(shí)驗(yàn)時，內(nèi)參的條帶強(qiáng)度也要適當(dāng)控制。不要讓內(nèi)參條帶發(fā)生過度曝光的情況，尤其是用 X 膠片曝光的。如果內(nèi)參條帶過度曝光，條帶會顯得很寬，妨礙對條帶正確強(qiáng)度的判讀，進(jìn)而影響對其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。最好的內(nèi)參結(jié)果是： 窄窄的，黑色實(shí)心條帶。

 

 

貨號：CSB-MA000071M0m

種屬反應(yīng)性：Human

免疫原：Recombinant Human GAPDH protein

應(yīng)用范圍：ELISA, WB, IHC, IP, IF, FC

引用文獻(xiàn)：A fluorescence method for determination of glucose transport by intestinal BBMV of common carp , Yang LP,et al.Anal Biochem,Aug 26

 

 

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