nf kappa b報告基因穩轉細胞株構建
日期:2023-05-10 15:14:42

NF-κB(核因子 kappa B)轉錄因子,在細胞的多種生理和病理過程中發揮關鍵作用。為了探究 NF-κB 信號通路的分子機制,需要構建 NF-κB 報告基因穩定轉染細胞株。以下是構建方法的詳細步驟:
一、選用適當的報告基因
在構建 NF-κB 報告基因穩轉細胞株之前,需要先確定適合作為報告基因的啟動子。目前常用的啟動子有 IL-8、MCP-1 等,其中 IL-8 啟動子在很多細胞中都能受到 NF-κB 的調控。因此,通常采用 IL-8 啟動子驅動的熒光蛋白基因(如GFP、Luciferase等)作為 NF-κB 報告基因。
二、構建 NF-κB 報告基因載體
將 IL-8 啟動子和熒光蛋白基因(如GFP、Luciferase等)克隆到適當的表達載體中,構建出 NF-κB 報告基因載體。
三、細胞株篩選和轉染
將構建好的 NF-κB 報告基因載體轉染到目標細胞株中。在此之前,需要先選定適合的細胞株。一般來說,IL-8 是一種炎癥介質,與炎癥相關的細胞(如肝癌細胞、骨髓瘤細胞等)中 NF-κB 信號通路比較活躍,因此選擇這類細胞可提高報告基因的表達。
對于細胞株的篩選,可以使用不同濃度的篩選劑(如抗生素)進行對照實驗,選定最佳投入量和最佳篩選劑濃度。隨后,利用熒光顯微鏡或熒光素酶檢測等方法,篩選出表達最高的穩定轉染細胞株。
四、NF-κB 激活實驗及結果分析
在得到 NF-κB 報告基因穩定轉染細胞株后,可以對其進行 NF-κB 激活實驗,并對實驗結果進行分析。例如,可以使用 NF-κB 激活劑(如 TNF-α)或抑制劑(如 BAY11-7082)刺激或抑制細胞株,然后通過熒光顯微鏡、熒光素酶檢測、Western blot 等方法檢測報告基因的表達水平變化,并與對照組進行比較。
構建 NF-κB 報告基因穩轉細胞株是研究 NF-κB 信號通路分子機制的重要手段。通過篩選出表達量高且穩定的細胞株,并對其進行實驗,可以更深入地了解 NF-κB 在細胞內的調控機制,為相關疾病的研究提供新思路和方法。
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