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如何驗(yàn)證fc受體信號通路激活

日期:2023-04-23 15:21:42


    Fc受體(FcR)是廣泛存在于免疫細(xì)胞表面的一類受體,可以識別和結(jié)合抗體Fc段。Fc受體激活后,可通過一系列信號傳導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞的生理功能。在研究中,為了證明Fc受體信號通路的激活,通常需要進(jìn)行下面的一些試驗(yàn)。
 
Western blotting分析
    Western blotting能夠檢測到Fc受體激活后的下游蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。當(dāng)Fc受體激活后,下游信號通路會(huì)被激活,并導(dǎo)致一系列蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。將免疫細(xì)胞暴露于Fc受體激動(dòng)劑中,然后使用Western blotting技術(shù)檢測已知的信號通路蛋白的表達(dá)變化,如Lyn、Syk、Akt等。Western blotting還可以檢測蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài),利用磷酸化狀態(tài)的變化進(jìn)一步證實(shí)Fc受體信號通路的激活。
 
流式細(xì)胞術(shù)
    流式細(xì)胞術(shù)通常用于檢測免疫細(xì)胞表面Fc受體的表達(dá)水平。通過使用攜帶熒光標(biāo)記的抗體,細(xì)胞表面Fc受體可以被檢測到。在Fc受體激動(dòng)劑處理后,使用流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測下游信號通路的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(如CD69、CD25等)也是一種證實(shí)Fc受體信號通路激活的方法。
 
實(shí)時(shí)定量PCR分析
    實(shí)時(shí)定量PCR可以用來檢測Fc受體激活后的mRNA表達(dá)水平。首先,提取免疫細(xì)胞總RNA,然后合成cDNA。之后,利用特異性引物和TaqMan探針來擴(kuò)增感興趣的基因,并通過實(shí)時(shí)熒光鑒定獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。這些數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步用于比較組間樣本Fc受體信號通路激活的差異。
 
磷酸化技術(shù)
    蛋白質(zhì)磷酸化是Fc受體信號通路激活的一個(gè)重要步驟。因此,對于Fc受體的磷酸化狀態(tài)進(jìn)行檢測,可以間接證實(shí)Fc受體信號通路的激活。主要有兩種技術(shù)可用于磷酸化檢測:磷酸化Western blotting和磷酸化抗體陣列。磷酸化抗體陣列可以同時(shí)檢測上千種蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài),是一種高通量的檢測方法。
 
    通過Western blotting,流式細(xì)胞術(shù),實(shí)時(shí)定量PCR和磷酸化技術(shù)等方法,可以檢測Fc受體激活后下游蛋白質(zhì)、mRNA表達(dá)及磷酸化狀態(tài)的變化情況,進(jìn)而間接證實(shí)Fc受體信號通路的激活。


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