大腸桿菌蛋白表達實驗流程

日期：2023-06-06 13:27:15

大腸桿菌（Escherichia coli）常被用于蛋白表達實驗，因為其易于培養、生長速度快且產量高。本文將介紹一個常見的大腸桿菌蛋白表達實驗的流程。

一、基因克隆

1、選擇適當的質粒載體

質粒DNA是一個小型的環形分子，在基因工程中被廣泛應用。選擇一個適當的質粒載體對于蛋白表達非常重要。一般而言，常見的質粒載體有pET系列、pGEX系列等。根據需要選擇含有不同誘導子和選擇標記的質粒載體。

大腸桿菌蛋白表達

2、目的基因擴增

將目的基因擴增后，將其接入到質粒載體的多克隆位點上。這一步可以通過PCR方法來進行擴增，也可以通過化學合成的方式獲取到序列完整、長度合適的基因片段。同時，在PCR擴增過程中，應考慮到靶基因的大小和構建的質粒載體的限制酶切位點的配對問題。

3、活性測定

在將目的基因接到質粒載體后，可進行限制性酶切鑒定、DNA測序鑒定等活性測定，以確定目的基因序列是否正確。

二、轉化

將質粒載體轉化入大腸桿菌中，使其在細菌內表達。轉化方法有化學轉化法、電轉化法和熱激轉化法等。

三、篩選陽性克隆株

轉化后需要對大腸桿菌進行篩選。常用的方法是在含有抗生素的LB平板上篩選，含有適合質粒載體選擇標記的抗生素。

四、蛋白表達

1、預培養

將大腸桿菌陽性克隆株接入到LB培養基中預培養，通常為37℃、200-250rpm振蕩培養。

2、誘導表達

當大腸桿菌發展到指定的OD600值時，添加誘導劑進行表達。在此過程中應選擇合適的誘導濃度和時間，不同的質粒載體可能對誘導劑的反應存在差異。

3、加入輔酶

輔酶對于某些蛋白質表達至關重要。如在pET質粒中，可以添加輔酶T7。

4、分析蛋白表達

通過采集樣品、離心、液氮凍存等方法來分析蛋白表達的情況，如采用SDS-PAGE技術進行蛋白質分離，并采用Western blotting技術進行檢測。

五、提取純化

1、細胞破碎

為了提取表達的蛋白質，需要對細胞進行破碎。一般使用化學破碎法、超聲波法、高壓法等方法將細胞破碎。

2、純化

破碎后的混合物中含有多種蛋白質和其他雜質，需要進行純化。常見的純化方法有親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等。

通過以上流程，大腸桿菌中的目的基因可以得到表達，并且通過適當的純化方法，可以提取高純度的目的蛋白質。