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真菌原生質(zhì)體制備技術(shù)

日期:2010-09-06 11:24:30

1.  滅菌物品:

(1)  大濾紙:
(2)  滅菌針筒(含脫脂棉和玻璃釬維)
(3)  脫脂棉
(4)  離心管
(5)  無(wú)菌ddH2O
(6)  0.6M MgSO4
(7)  培養(yǎng)基:

A.  等滲培養(yǎng)基(RCM):麥芽汁 1%,酵母膏 1%,蛋白胨 0.4%,葡萄糖 0.4%,pH自然,用0.6M蔗糖配制。
  B.  破膜培養(yǎng)基:麥芽汁 1%,酵母膏 1%,蛋白胨 0.4%,葡萄糖 0.4%,pH自然,用水配制。也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作為等滲培養(yǎng)基,破膜培養(yǎng)基不加0.6M蔗糖即可。

(8)  溶壁酶酶液:1.5%,用0.6MMgSO4配制,過(guò)濾除菌;
(9)  培養(yǎng)皿:根據(jù)樣品個(gè)數(shù)

2.  制備方法:

(1)  稱取離心管重量并記錄;
(2)  用接種針挑出菌絲,并用滅菌雙蒸水沖洗一次,然后用無(wú)菌的0.6M MgSO4沖洗兩次,用滅菌的濾紙吸干,放入已知重量的離心管,稱重并記錄;
(3)  計(jì)算得到菌絲重量,按0.2(g):1(mL)加入滅菌酶液,震蕩均勻;
(4)  28℃,3~4小時(shí),搖床震蕩(輕微),酶解,同時(shí)每30min鏡檢觀察原生質(zhì)體數(shù)量;
(5)  滅菌注射器(含脫脂棉和玻璃釬維)過(guò)濾;
(6)  離心:2500rpm,2min
(7)  用0.6M MgSO4洗滌沉淀3次;
(8)  用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量;
(9)  鏡檢計(jì)數(shù);記錄;
(10)  涂板后再生培養(yǎng),第7天后每隔1天計(jì)數(shù)一次。


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