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Native-PAGE常見問題分析

日期:2010-08-03 14:35:00

1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時預電泳是怎么回事的?預電泳時要加6×DNA上樣緩沖液嗎?電泳1-2小時再加結合反應產物嗎?

預電泳是除去凝膠中沒有聚合的單體和雙體和聚合引發劑,提高分辨率,不加任何物質,一般30-60分鐘后加樣電泳。

2. 銀染的步驟是什么?銀染的關鍵因素是什么?

步驟是:

(1) 固定:10%冰乙酸30min。

(2) 清洗:雙蒸水沖洗凝膠2次,每次1min。

(3) 染色:染色液(1g硝酸銀,1.5ml 37%甲醛,1l 雙蒸水。現配)染色30min。

(4) 清洗:迅速洗凝膠1次。

(5) 顯影:30g碳酸鈉,1.5ml 37%甲醛,200μl 10mg/l 硫代硫酸鈉。顯影至清晰帶紋出現。

成功銀染的關鍵因素包括:

(1) 用超純水(比如,NANOpure或Milli-Q純化)或者是雙蒸水作銀染。

(2) 用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級的碳酸鈉。

(3) 在染色后,水清洗所用時間的長短很重要,用不超過5-10秒的時間清洗膠,然后放入顯色溶液中,一般在水里浸一下就好。

(4) 甲醛和硫代硫酸鈉(400μl/1ml)在使用前,及時加入到顯色液中。

(5) 在使用前及時配染色液。

3. 變性PAGE的上樣緩沖液配方?如何準備上樣的蛋白?是將細胞用超聲破碎,還是用細胞裂解液,大多細胞裂解液中均含有SDS,不知有沒有用于非變性PAGE的裂解液.具有操作步驟是什么?

非變性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上樣緩沖液可以用普通的loading buffer,含有Tris,溴芬蘭以及甘油即可,甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己配。細胞超聲即可,超聲后離心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer為1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。還有一點就是要在配gel時考慮能使蛋白多聚體穩定的因素。

4. 做了naive---PAGE沒有條帶,蛋白質是純品,分子量很大,怎么回事呢?

因為分子量很大,8%的膠濃度較合適。加樣時加個marker,可以檢測膠制備是否有問題。銀染方法比較靈敏,如果蛋白是一種酶,且可使某種底物顯色的話,可以用活性染色試試,更靈敏。


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