中和試驗檢測應用
日期:2010-07-30 14:59:01
病毒或毒素與相應的抗體結合后,失去對易感動物的致病力,謂之中和試驗。本試驗主要用于:(1)從待檢血清中檢出抗體,或從病料中檢出病毒,從而診斷病毒性傳染病;(2)用抗毒素血清檢查材料中的毒素或鑒定細菌的毒素類型;(3)測定抗病毒血清或抗毒素效價;(4)新分離病毒的鑒定和分型,中和試驗不僅可在易感的實驗動物體內進行,亦可在細胞培養上或雞胚上進行。試驗方法主要有簡單定性試驗、固定血清稀釋病毒法、固定病毒稀釋血清法、空斑減少法等。
1、血清中和實驗鑒定新城疫
血清中和實驗既可用已知抗雞新城疫病毒的血清來鑒定可疑病毒,又可用已知的新城疫病毒來測定雞血清中是否含有特異性抗體,以確定雞群是否感染過新城疫。中和實驗可以在雞胚或細胞培養以及易感雞中進行。方法是:在雞新城疫免疫血清(或待檢血清)中,加入一定量的待檢病毒(或已知病毒),兩者混合均勻后,接種10~11日齡的SPF雞胚,或雞胚成纖維細胞,或有易感性的雞,并設立不加血清的病毒對照。結果注射血清和病毒混合材料的雞胚或雞不死亡,雞胚成纖維細胞無病變,而對照組死亡或細胞培養出現病變,則肯定為新城疫病毒。
2、血清中和實驗診斷豬瘟
將不同稀釋度的血清與已知濃度的稀釋病毒混合,再接種細胞培養物進行培養,18-24h后進行熒光抗體檢查;或與豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)中和,接種到兔中觀察兔體溫反應,以此確定血清的終點滴度。在西歐最常用的方法是過氧化物酶中和實驗(NPLA),而在一些北美洲和拉丁美洲國家則多使用免疫過氧化物酶單層實驗(1PMA)方法。
3、血清中和實驗檢測豬繁殖與呼吸綜合征
一般來說,在群體水平上血清學診斷易操作,特異性強,敏感性高。但對個體的檢測則比較困難,有時出現非特異性反應,但可以在2~3周后取樣復測解決此問題。血清學檢測一般用吸附實驗(如IPMA、IF、ELISA),這些實驗常用某種抗原型的病毒進行,對其他抗原異型病毒抗體的靈敏度較低。應用抗體結合試驗,在病豬感染了7~14天檢出抗病毒抗體,30~50天抗體滴度出現高峰。有些在病豬感染后3~6個月內血清轉為陰性,有些病豬血清陽性維持較久。中和抗體在病豬感染后出現較慢,但滴度不高。可在感染后3-4周檢測到中和抗體,這種抗體能維持1年或更長時間。有報道,在血清中和實驗中使用補體能提高試驗的靈敏度。關于病豬感染后血清陽性持續時間的長短,目前尚未進行廣泛深入的研究,因其有可能隨實驗方法不同而異。母源抗體半衰期為12~14天,一般仔豬在出生后4~8周內可檢測到病毒,隨母豬生產時的滴度及所用試驗方法而異。在污染的環境中,血清學檢測為陽性的母豬所產仔豬能在3~6周齡時血清轉為陽性。應用巨噬細胞分離病毒以及利用兩類血清型病毒的IPMA在實驗室容易操作,這種試驗可用MARC-145細胞系增殖歐洲型病毒和美洲型病毒操作。使用MARC-145細胞系做間接免疫熒光實驗(1FA)能順利進行PRRSV血清學反應。目前,靈敏度高、特異性強商品化的ELISA試劑盒已經上市。同時,國內學者還開發了乳膠凝集試劑盒,可用于PRRSV抗體快速監測。
血清中和實驗檢測PRRS抗體雖然特異性好,但PRRS的SN抗體比IFA抗體在血清中出現得晚,一般在感染后的4~6周才出現中和抗體,因此SN不適宜進行早期診斷。Christianson等(1992)報道SN的敏感性比IFA低,Yoon等(1994)對常規SN進行改良,在實驗中加入20%豚鼠血清以增加補體的含量,從而提高SN的敏感性,在感染后的9~11天即可檢測到較高滴度的SN抗體。SN抗體比IFA抗體存留的時間長,可維持半年以上。但由于對急性感染的敏感性較差,要求血清無污染,而且細胞培養工作量大,技術性強,目前僅限于實驗室研究應用。
4、病毒中和實驗(VNT)診斷禽流感
以中和實驗來鑒定或滴定流感病毒時,常用雞胚或組織培養細胞,操作方法與其他病毒(如NDV)的中和實驗相同。一般常用固定病毒稀釋血清法,IOOEIDs或1000TCID5的AIV與RED處理過的倍比稀釋的血清等量混合,室溫lh,每個雞胚或每瓶細胞接種0.2ml,每個稀釋度接種4個胚或細胞瓶,37℃孵育72h至7天,檢查雞胚尿囊液的血凝活性或細胞培養物的血細胞吸附作用,按標準方法算出中和效價,不出現血凝活性或血細胞吸附作用的最高稀釋度即為血清中和抗體滴定。
NT實驗是最敏感而特異的血清學方法,只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應、特別是與吸附到宿主細胞上的病毒表面抗原相對應時,才能在實驗中取得滿意的顯示效果。因此,某一個血清型的中和實驗抗體只與同組內地其他病原表現出有限的交叉反應。由于病毒中和實驗操作煩瑣,耗時費料,臨床上幾乎不用,但作為經典方法在病毒鑒定中起著重要的作用,許多新的檢測方法都要以之為標準來進行比較。