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挑出CpG甲基化位點的新策略

日期:2014-06-18 09:11:27

 

DNA甲基化是基因表達的一種有效的調節器。DNA甲基化主要發生在富含CG的區域,所以稱為CpG。如CpG島位于某基因的啟動子區域,CpG島的甲基化會顯著降低甚至完全沉默該基因的轉錄,繼而影響蛋白的表達。但是,如何決定一個目標位點的甲基化是否會影響轉錄,是具有挑戰性的。最近,約翰霍普金斯大學的研究人員研制出一種新方法,可以闡明這個問題。

 

CpG二核苷酸上的DNA甲基化,是真核生物中被充分研究過的一種表觀遺傳轉錄調控機制。通常,這種形式的甲基化涉及到多個位點,但是單個CpG位點的甲基化也會影響基因的表達。為了促進單一位點甲基化研究的發展,約翰霍普金斯大學的Marc Ostermeier和他以前的研究生Brian Chaikind,開發出一種新技術,可以選擇優化的位點特異性DNA甲基轉移酶,相關研究結果發表在最近的《PLoS One》。

 

Ostermeier的這種最新方法以其研究小組以前描述過的一種方法為基礎,利用一種裂開的CpG甲基轉移酶——M.SssI,與可識別目標CpG位點側翼序列的鋅指結構域(ZFD)熔合在一起。

 

Ostermeier解釋說:“我們的想法是,分裂甲基轉移酶,這樣它就再也不能很有效地組裝,然后你用DNA作為模板,在你想要甲基化的位點上,幫助組裝甲基轉移酶。因此,你增加了這兩半甲基轉移酶的局部濃度,可以化解它們沒有組裝好這一問題。然后,它們可以組裝和甲基化那個位點。”

 

雖然Ostermeier的方法增加了期望CpG位點的甲基化,但仍然有明顯脫離目標的CpG甲基化。因此,在最新的進展中,他和Chaikind轉向努力降低非特異性DNA甲基化,同時保持目標位點甲基化。

 

新方法利用一個誘變的質粒文庫,這些質粒包含N末端M.SssI片段/ZFD熔合的編碼基因和C末端M.SssI片段/ZFD熔合的編碼基因。C末端M.SssI片段,在5個選定的殘基上攜帶隨機變異,研究人員推測,這會減少其DNA的親合力,而不影響催化活性。

 

利用位于甲基化敏感的FspI限制位點(兩側是鋅指結合序列)的質粒中的目標CpG位點,研究人員選擇來自FspI消化的甲基化依賴保護。然后,他們增加了創新的一步,利用與眾不同的限制酶McrBC,針對非特異性的甲基化。McrBC可消化包含兩個不同甲基化位點(而不僅僅是一個單一甲基化位點)的DNA,導致在目標CpG位點以外的一個或多個CpG位點甲基化的任何質粒DNA被消化。

 

FspIMcrBC消化后,核酸外切酶III消化會破壞任何裂開的質粒,留下編碼高度特異性M.SssI片段/鋅指熔合蛋白的完整質粒,用于另一輪的轉換和選擇。

 

從他們篩選中識別出的47個變體中,作者得到了一種優化的DNA甲基轉移酶,能顯著降低非特異性甲基化60倍,目標特異性甲基化降低很少,僅從94%降到了79%

 

ChaikindOstermeier通過交換鋅指結構域,繼續顯示他們系統的多功能性,這些結構域結合有人類細胞間黏附分子1ICAM1)基因啟動子區中的一個特異CpG位點的側翼序列,表明該位點被甲基化,但是非目標位點卻沒有。

 

目前,該研究小組計劃在真核細胞中靶定那個單一的ICAM1 CpG位點,以檢測其位點特異性甲基化是否像其他研究顯示的那樣,會影響ICAM1的表達,也將驗證這種位點特異性CpG甲基轉移酶在真核生物研究中的效用。

 


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