隨著大家對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的興趣日益增加，開展單細(xì)胞RNA-seq的方法也在不斷涌現(xiàn)。近日，斯坦福大學(xué)的研究人員比較了市場上各種單細(xì)胞RNA擴(kuò)增方法，以系統(tǒng)評估單細(xì)胞RNA-seq方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。他們的研究結(jié)果發(fā)表在《Nature Methods》在線版上。

目前，整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的高通量測序（RNA-seq）已廣泛用于各種組織的基因表達(dá)分析。然而，人們開展單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的愿望也越來越強(qiáng)烈，這是因?yàn)橛行┘?xì)胞量少珍貴，不足以開展傳統(tǒng)的RNA-seq，也有人希望對異質(zhì)群體中的細(xì)胞亞群開展分析。過去的基因表達(dá)“平均值”已不再能滿足人們的需求。

近年來，開展單細(xì)胞RNA-seq的各種方法時(shí)有報(bào)道，但關(guān)于這些方法的通量和性能還存在一些問題。比如說，性能主要是通過靈敏度和精確性來評估的。然而，為了評估測定方法的有效性，還應(yīng)當(dāng)評估準(zhǔn)確性，即測量值與真實(shí)值之間有多接近。

為此，斯坦福大學(xué)生物工程系的Stephen R Quake領(lǐng)導(dǎo)的研究小組對102個(gè)人類單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了定量的RNA-seq分析。他們采用了三種單細(xì)胞RNA擴(kuò)增方法，分別為SMARTer Ultra Low RNA Kit（Clontech）、TransPlex Kit（Sigma-Aldrich）以及利用C1微流體系統(tǒng)（Fluidigm）進(jìn)行SMARTer cDNA合成。同時(shí)，他們也利用大量總RNA開展傳統(tǒng)的RNA-seq，并通過多重qPCR對同一細(xì)胞類型中的40個(gè)基因進(jìn)行獨(dú)立定量，來評估單細(xì)胞方法的準(zhǔn)確性。

由于很難獲得絕對表達(dá)水平，研究人員計(jì)算了每種細(xì)胞的相對表達(dá)水平，即相對所有轉(zhuǎn)錄本中位數(shù)表達(dá)的基因表達(dá)。所產(chǎn)生的無量綱數(shù)應(yīng)獨(dú)立于測定方法，可直接比較，以確定方法的準(zhǔn)確性。他們發(fā)現(xiàn)，對于單細(xì)胞方法，qPCR和RNA-seq的表達(dá)值相關(guān)性良好（r > 0.84），證實(shí)了單細(xì)胞RNA-seq方法能夠以定量的方式檢測基因表達(dá)，與目前的金標(biāo)準(zhǔn)qPCR方法一致。

有趣的是，各種方法之間的相關(guān)系數(shù)和線性回歸的斜率不同。相關(guān)系數(shù)表示每種方法能夠在多大程度上再現(xiàn)qPCR所測定的表達(dá)，而斜率表示一些失真。他們發(fā)現(xiàn)，以納升體積開展樣品制備（C1系統(tǒng)）產(chǎn)生了幾乎為1的回歸斜率，表明絕對準(zhǔn)確性最高。一種可能的解釋是，減小反應(yīng)室的體積可增大反應(yīng)物的有效濃度，減少模板與非特異分子之間的競爭，從而減少擴(kuò)增偏向。

此外，研究人員還直接比較了微升和納升級的樣品制備，發(fā)現(xiàn)對于qPCR和RNA-seq，以納升體積制備的樣品都產(chǎn)生了更少的假陽性。作者認(rèn)為，與管式的樣品制備相比，C1平臺表現(xiàn)出一些優(yōu)勢，包括假陽性低和偏向小。

作者總結(jié)道，他們的結(jié)果表明，單細(xì)胞RNA-seq可產(chǎn)生與qPCR相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，特別是在以納升反應(yīng)體積制備樣品時(shí)（如微流體裝置C1）。通常在樣品制備過程中引入的偏向減小，而相關(guān)性也進(jìn)一步提高。他們希望，低偏向、高通量的單細(xì)胞RNA-seq將讓原代組織的研究變得常規(guī)。