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Nature方法:大型單基因敲除人類單倍體細胞庫

日期:2013-08-27 13:18:25

由奧地利科學院和維也納Haplogen的研究人員領導的一個研究小組,利用一種稱之為“基因捕獲”( gene trap)的技術構建出了一個人類單倍體細胞庫,該細胞庫中包括有3000多種細胞系,每個細胞系都具有一種不同的突變基因。這項研究工作發布在825日的《自然方法》(Nature Methods)雜志上。

 

渥太華大學教授William Stanford(未參與該研究)說:“我認為這可能是一個相當有趣的資源。我想人們將會欣然接受它。它的作用看起來非常的強大。“

 

利用這些單倍體細胞系可以大大幫助推動基因的功能性研究。由于這些細胞系只含有一個完整染色體組,因此等位基因上的突變效應不會被另一條染色體所掩蓋。斯坦福大學教授Jan Carette說:“相比于其他的技術,完全基因敲除complete knockout)可以獲得更強大的表型。”來自奧地利科學院分子醫學研究中心(CeMM)的Sebastian Nijman同事們針對稱作為KBM7的人類細胞系展開了研究工作。

 

KBM7來源于一名慢性粒細胞白血病患者,將8號染色體排除之外KBM7算是一種單倍體細胞系。盡管這些細胞是單倍體,它們仍然能夠執行基本功能維持活力。“一些人認為單倍體細胞是自然細胞類型的畸形物,但實際上在細胞水平上單倍體與生命體極其的相容,”Carette說。為了構建出每種突變,研究人員用偏好于整合到活性轉錄的基因中的反轉錄病毒來感染細胞。“結果基因幾乎完全被沉默,就像進行了基因敲除,”Nijman說。

 

每個突變株都包含一個GFP標記和一個獨特的遺傳條形碼,由此可以識別克隆混合物。這些克隆另一個特征是它們的突變可以逆轉。在“基因陷阱”載體的兩側是loxP序列。向這些細胞中加入Cre重組酶,針對loxP進行切除,研究人員可以除去這一基因捕獲,恢復正常的蛋白質生成。

 

為了驗證他們的細胞庫,Nijman和同事們確定了他們構建出來的一些克隆的特征。例如,一個JAK2基因捕獲的克隆,顯示STAT1磷酸化降低。“盡管是在意料之中,這是第一次利用完全失活的JAK2基因在人類細胞中證實這一點,”Nijman說。

 

“理論上講,這樣的一個完全覆蓋所有表達基因(包括編碼基因和非編碼基因)的細胞庫,為系統地研究幾乎所有的細胞過程,如細胞周期控制、代謝、耐藥或藥物敏感等所需的基因功能及作用提供了一個極好的平臺,”新加坡國立大學Yunhan Hong說。到目前為止,該研究小組已經構建出了幾千個突變體,可通過與HaplogenCeMM.合作進行購買。

 

蘇黎世分子健康科學研究所Anton Wutz(未參與該研究)說,他認為臨床研究人員將會尤其對這些克隆感興趣。“細胞生物學或許能夠生成自己的突變細胞系,但缺少實驗室條件、想要檢測患者突變的臨床醫生現在可以索取克隆并進行檢測,以確定他們看到的是真正的因果關系,還是只相關卻無功能性意義。”

 

但這些克隆也存在一些局限。尤其是,KBM7細胞并不表達所有的基因。“將這種方法擴展到不同器官的單倍體細胞,尤其是單倍體胚胎干細胞,將大大提高有用性,”Hong說。Nijman補充說,他的研究小組還在技術擴大這一細胞庫,由于載體的插入是隨機的,生成新的突變將會越來越難。將基因捕獲技術與轉錄激活因子樣效應物(transcription activator-like effectors TALE)和RNA 引導性核酸酶( RNA-guided nucleasesRGNs)等其他技術相結合,有可能幫助研究人員擴展這一細胞庫。

 


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