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Nature子刊:基因組編輯新技術(shù)

日期:2013-08-14 08:58:52

許多的實(shí)驗(yàn)室都在利用近期發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌和古細(xì)菌天然防御機(jī)制作為基因組編輯工具。與真核生物的RNA干擾過程相似,這一CRISPR-Cas系統(tǒng)通過序列特異性切割外源核酸,保護(hù)了原核生物免受病毒攻擊。而CRISPR-Cas系統(tǒng)有可能發(fā)生非特異性靶向,導(dǎo)致基因組別處突變,也引起了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。

 

在發(fā)表于81日《自然生物技術(shù)》(Nature Biotechnology)雜志上的一項(xiàng)新研究中,哈佛醫(yī)學(xué)院的George Church及同事們比較了CRISPR-Cas系統(tǒng),與以轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子transcription activator like effectorsTALEs)為基礎(chǔ)的另一種基因表編輯工具在人類細(xì)胞中的靶向特異性。重要的是,Church研究小組還提出了一種新方法減少了利用CRISPR-Cas時(shí)的潛在脫靶效應(yīng)。

 

CRISPR-Cas系統(tǒng)是通過將短鏈外源遺傳物質(zhì)整合到宿主基因組中來發(fā)揮作用的。這些序列被轉(zhuǎn)錄并加工成小RNAs,隨后小RNAs可與Cas蛋白復(fù)合物一起結(jié)合與小RNA序列相匹配的外源DNARNA,從而導(dǎo)致入侵核酸遭到序列特異性地切割和破壞。

 

在新研究中,Church和他的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),TAL效應(yīng)子容許靶序列1-2個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配;由單導(dǎo)向RNAsingle-guide RNA)和Cas9蛋白構(gòu)成的復(fù)合物能夠容許1-3個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配。“這不是一個(gè)大問題,但它卻可能會(huì)導(dǎo)致一些脫靶效應(yīng),”洛克菲勒大學(xué)CRISPR干擾專家Luciano Marraffini說。

 

為了解決這一問題,Church研究小組生成了一系列的Cas9突變體,這些Cas9突變體沒有生成雙鏈斷裂,而是引入了偏移缺口,每個(gè)缺口只影響一條DNA鏈。盡管這一策略實(shí)質(zhì)上造成了雙鏈斷裂,它通常不會(huì)導(dǎo)致非同源末端連接(雙鏈斷裂的一種細(xì)胞修復(fù)機(jī)制)引起的插入或刪除。因此,這種方法可能會(huì)減少脫靶效應(yīng)。

 

利用核酸酶系統(tǒng)重新構(gòu)建基因組并非全新的研究。研究人員過去也曾為了減少脫靶效應(yīng),而制造出了另一種基于鋅指核酸酶的基因組編輯工具。今年早些時(shí)候,Marraffini和他的合作者們報(bào)告稱,可將Cas9轉(zhuǎn)換為一種切口酶,減少與DNA修復(fù)機(jī)制相關(guān)的脫靶突變。

 

然而,Church的方法是否確實(shí)能減少脫靶效應(yīng)仍有待證明。Sangamo BioSciences公司首席科學(xué)官Philip Gregor 說:“Church朝著解決這一問題邁出了第一步。但本文沒有對(duì)這一切口誘導(dǎo)雙鏈DNA切割方法的特異性進(jìn)行評(píng)估。解決這一特異性問題非常的重要。”

 

Sangamo公司當(dāng)前正在開展臨床試驗(yàn),評(píng)估用鋅指核酸酶來治療HIV/AIDs。盡管Church指出相比于鋅指核酸酶和TAL效應(yīng)子,CRISPR-Cas系統(tǒng)要容易100-1000倍,但Gregory仍有所懷疑。“至少以它當(dāng)前的形式,CRISPR-Cas9系統(tǒng)極易發(fā)生重要的脫靶活性,其可能超過期望目標(biāo)位點(diǎn)的切割水平,”Gregory說。

 

盡管存在這些擔(dān)憂,Church的研究還是讓科學(xué)團(tuán)體產(chǎn)生了一些樂觀的看法。“到目前為止已經(jīng)證實(shí)CRISPR-Cas9具有較差的基因組編輯特異性,盡管高效,它走向了垃圾場(chǎng)。這一雙切口方法及時(shí)地停住了垃圾車。”

 


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