多重PCR能夠在提高通量的同時節省樣品降低成本，它需要耗費更多的時間和精力，同時也會給用戶回報更豐富的數據。本文介紹了一些實驗技巧和商業化工具，希望能幫您輕松獲得好結果。

PCR的重要性毋庸贅述，這一諾貝爾獲獎技術的普及帶動了現代基因組學、鑒定技術、醫療診斷等領域的發展。如今，PCR幾乎是每個實驗室必備的通用技術，不過要跑好一個PCR也并非那么簡單，由于PCR反應很靈敏，PCR的效果很容易受到污染和脫靶效應的影響。我們在設計PCR實驗時須得將引物設計、反應條件和酶的選擇一一考慮周全。這一點在多重PCR中尤為明顯，因為多重PCR需要在一個管中同時檢測多個目標（通常二至五個）。多重PCR應用也很廣泛，可以用來做基因表達分析、SNP分型、STR分型等鑒定以及病原菌檢測等等。

多重PCR的反應數相對較少，所消耗的試劑也較少，是一個頗為經濟的選擇。人們往往選用多重PCR來處理臨床樣本等珍貴樣本，或者用來增加實驗通量，每個樣本所需的孔少了，那么一個微孔板自然就能容納更多的樣本。

反應體系包括模板DNA、兩個擴增引物、酶和緩沖液，一般最后通過凝膠電泳來檢測所得的擴增產物。定量PCR除上述元素之外，還需要熒光探針以便檢測反應的進行，不過就不需要進行凝膠電泳了。

從一般PCR到多重PCR，其實驗設計的難度也隨之翻倍。如果說擴增一個片段需要三條引物，那么兩個片段就需要六條，三個片段需要九條，以此類推。這些引物既不能互相結合，也不能與模板DNA上目標片段以外的區域結合。此外，我們還要考慮同時檢測不同的擴增子，要么就使不同擴增子大小不一以便凝膠電泳，要么就讓它們帶上不同熒光染料以便區分。更麻煩的是，多重PCR中的不同擴增片段還會互相競爭資源，其結果是高豐度模板能夠被很容易的檢測到，而低豐度的模板徹底淪為背景。

上述困難都是進行多重PCR的絆腳石，“大多數人都嫌太麻煩了，”Life Tech的資深科學家Jonathan Wang說“有許多客戶對多重PCR感興趣，但遇到這些麻煩之后，他們都選擇了放棄，”安捷倫公司的產品經理Laura Mason補充道。

實驗設計小tips其實假如咱們迎難而上，還是有許多工具和小竅門可以幫得上忙的。NEB的資深科學家Nicole Nichols為正在設計多重PCR反應的研究者們推薦了以下五條基本原則。

原則一A：引物設計

“引物設計這一步是沒法跳過的，” Nichols說。“從一開始就好好注意細節，最終將能為你節省很多優化時間。”

她推薦引物設計得比一般稍長一點（24–35 bases），解鏈溫度稍高一點（65 °C以上），并且GC含量控制在50–60%。當然除此以外，PCR引物設計的標準規則是肯定要遵守的：保持幾對引物解鏈溫度相似、避免互補序列、避免3’端出現超過3個連續的G或C，以及以及驗證、驗證、再驗證。

多重定量PCR不能用SYBR Green等插入染料，探針法是唯一的選擇，例如Life Tech公司的TaqMan®探針或者IDT公司的PrimeTime® 探針。Bio-Rad公司的經理Keith Cockrum建議將這些探針的解鏈溫度設計得比擴增引物的高7–8 °C。“我們要讓探針先退火，”他解釋說，要不然序列就會在沒有探針的情況下進行擴增，他將這種無法檢測到的擴增反應稱為“endogenous PCR”。“這是我們想要的特異性PCR反應，我們只是無法檢測到其發光，”他解釋道。

原則一B：引物驗證

引物驗證必不可少的步驟，Cockrum建議，首先將每對引物分別在模板上進行測試，這里的模板指對照樣本，例如安捷倫公司的QPCR Reference Total RNA。可用SYBR Green熔解曲線分析引物對是否擴增出單一產物。另外還要引入溫度梯度，以確定所有引物都能起作用的溫度范圍。如果有一對引物不能與其他引物一同起作用，她建議直接放棄這對引物重新開始設計，“放棄并重新設計其實比不斷優化要好的多。”

如果要做多重定量PCR，Cockrum建議先在單重反應中測試探針，用一系列稀釋度來確定每個探針的動態區域。最后再把所有元素組合到一起，確保各自的特異性、敏感性、動態區域等沒有受到影響。“如果將以上都進行了論證，你就會擁有一個非常棒的多重PCR實驗，”Cockrum說。

原則二：引物濃度

Nichols推薦的第二項原則是，保證每個引物濃度都低于單重PCR中的濃度，否則“反應中的總引物濃度會就會太高”。傳統PCR反應中引物濃度為0.2 μM，那么我們可以試試0.15 μM（引物濃度范圍通常在0.05 μM至0.4 μM之間）。