多重PCR能夠在提高通量的同時節省樣品降低成本，它需要耗費更多的時間和精力，同時也會給用戶回報更豐富的數據。本文介紹了一些實驗技巧和商業化工具，希望能幫您輕松獲得好結果。

（上接：攻克多重 PCR之難上篇）

原則三、四、五：優化dNTP、MgCl2、聚合酶和鹽的濃度

現在剩下的就是調整反應條件了。要一次進行這么多種反應，我們當然不想在反應中缺了哪個組分。一般多重PCR需要更多的dNTP、鎂離子和聚合酶。Nichols推薦使用0.3 mM dNTP（而非標準的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反應體系5 units聚合酶（而非1.25 units）。最后再試試鹽濃度，“在優化的時候，增加鹽總會有幫助，尤其能增加特異性。”

PCR master mix含有緩沖液、鹽、dNTP、Mg和聚合酶，如果我們使用常規1.25× 或1.5×的PCR master mix就已經差不多做到了上述原則的三至五。另外，您還可以選用轉為多重PCR優化的產品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ™ Multiplex Powermix、或者安捷倫的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。

據安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經過專門設計的，能夠很好的解決同一管中不同反應相互競爭的問題。如果一個目標片段出現1000次，而另一個目標片段只出現了10次，那么后一個片段就很容易淪為背景?！拔覀兊亩嘀?/SPAN>PCR試劑盒能夠在同一個管中準確定量低豐度和高風度的目標片段，克服偏向性，”Mason說。

我能擴多少目標片段一般來說，最多能在同一個管中同時檢測到五個目標片段，這既是出于引物設計的考慮，也是由多重定量PCR的硬件條件決定的。實時熒光PCR儀通常最多檢測4至5個顏色通道，其中一個可能還要留作參考通道。凝膠電泳雖然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困難，因此還是最多達到五重PCR。 “設計更多是極具挑戰性的，”Cockrum說。

多重定量PCR的染料能進行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System、安捷倫公司的Mx30005P等等。據Cockrum介紹，Bio-Rad公司的CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System具有五個通道，每個通道配有單獨的激發光源和檢測器。在典型配置中，通道1用于FAM，通道2用于HEX或VIC，通道3用于Texas Red或ROX，通道4用于Cy5，通道5用于Quasar 705。目前最流行的選擇是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的最普遍的。Life Tech除了生產VIC外，近期又發布了兩個新染料ABY和JUN以及一個新passive reference dye——Mustang Purple。

Cockrum建議將染料強度與模板豐度結合起來，用最亮的染料（通常是FAM）配最少的模板，用最黯淡的染料（例如Cy5或Quasar 705）配豐度最高的模板（如看家基因）。

更多重的PCR當然，引物設計是多重PCR的最大障礙，不過一旦克服了這一障礙我們就能進行更多重的PCR反應。安捷倫的MassCode技術就能夠超越定量PCR儀帶來的硬件限制，安捷倫公司將這一技術推薦給那些想要同時篩選十個以上目標片段的用戶，例如可以用來檢測病原體。

MassCode技術融合了多重PCR和LC/MS技術。首先，開展多重PCR，每個引物都帶有一個化學標簽（tag）。隨后純化PCR產物，并上樣到LC/MS系統中，切除標簽用質譜儀進行檢測。2011年，安捷倫公司的科學家就進行了14重反應，對多種沙門氏菌進行檢測和分型。

引物設計軟件怎樣設計能夠相互兼容的引物呢？簡而言之，用軟件。現在市面上有很多免費的引物設計軟件，例如IDT公司的RealTime PCR calculator。Nichols選擇的是Primer3 (MIT, Cambridge, MA)，隨后通過UCSC Genome Browser再次篩選潛在的引物序列，以避免脫靶。

此外，也有不少商業化工具可供選擇，例如Premier Biosoft家的Beacon Designer（Bio-Rad公司有提供哦）。這個軟件能夠通過全基因組BLAST搜索來避免重復序列，通過結構預測來避免高度折疊區域，通過配對測試來剔除可能的引物二聚體。據該公司介紹，這一軟件能夠大大幫助多重PCR的引物設計，從上百萬種潛在組合中挑選出少量符合標準的引物呈獻給用戶，以便用戶進行實驗驗證。

多重PCR能夠在提高通量的同時節省樣品降低成本，它需要耗費更多的時間和精力，同時也會給用戶回報更豐富的數據。如果您有興趣進行多重PCR，那么希望本文中介紹的技巧和產品能夠使您的實驗更輕松，得到更好的結果。