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單分子測(cè)序輕松升級(jí)參考基因組

日期:2012-09-06 08:23:18

現(xiàn)代基因組學(xué)的最大需求之一,就是得到人類和模式生物的高質(zhì)量完成基因組。目前,人們利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)越來(lái)越多的物種(從原核生物到真核生物)進(jìn)行了基因組測(cè)序,取得了許多重要的研究成果。

 

不過(guò)大部分物種的基因組還中存在有大量的缺口gap,就目前的數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō),各種已測(cè)序物種的基因組中缺口gap所占的百分比從1.3%13%不等。這是由于二代測(cè)序技術(shù)生成的片段短,而過(guò)短的測(cè)序片段無(wú)法跨越高度重復(fù)和高GC含量的基因組區(qū)域。大量的基因組空白區(qū)域中可能存在有重要的生物學(xué)功能信息,如果無(wú)法補(bǔ)齊這些缺口,不僅不能獲得完整的基因組物理結(jié)構(gòu)圖,還會(huì)給基因組信息的解讀造成不小的困難。目前人們主要使用步進(jìn)PCR結(jié)合Sanger測(cè)序或者illumina/454 Pair-end測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)填充空白區(qū)域,但是這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,成本高,填充效率低,無(wú)法從根本上解決問(wèn)題。

 

美國(guó)Baylor醫(yī)學(xué)院的Richard Gibbs團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)行一項(xiàng)重要研究,利用單分子測(cè)序技術(shù)對(duì)模式生物的基因組草圖進(jìn)行升級(jí)。他們借助的正是Pacbio RS單分子測(cè)序的獨(dú)特之處,這一技術(shù)無(wú)需PCR過(guò)程,能夠輕松完成高GC含量片段和高度重復(fù)區(qū)域片段測(cè)序。該研究團(tuán)隊(duì)的目標(biāo)是準(zhǔn)確、自動(dòng)化、快速且可重復(fù)的進(jìn)行基因組升級(jí),他們還專門開發(fā)了高度自動(dòng)化的工具PBJelly,能夠?qū)?/SPAN>Pacbio測(cè)序得到的長(zhǎng)片段與基因組草圖進(jìn)行比對(duì),填補(bǔ)或減少草圖中的缺口,從而完善基因組草圖。

 

Richard Gibbs的團(tuán)隊(duì)利用PacBio的長(zhǎng)讀長(zhǎng),對(duì)兩個(gè)果蠅種(Drosophila pseudoobscuraDrosophila melanogaster,基因組缺口6.7M,占基因組大小5%)、虎皮鸚鵡(M. undulates,基因組缺口155M,占基因組大小11%)、黑子白眉猴(C.atys,基因組缺口198M,占基因組大小7%)的基因組進(jìn)行了升級(jí)。他們首先利用PacBio單分子測(cè)序技術(shù)進(jìn)行覆蓋(深度從4.4×到24×不等),然后使用PBJelly流程進(jìn)行分析。研究顯示長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)可以大大降低基因組中的缺口數(shù),其中D. melanogaster的基因組缺口數(shù)減少了15倍,虎皮鸚鵡和白眉猴的基因組缺口數(shù)減少了1.32.8倍,且這些基因組的缺口大小也減少了3-6倍。隨后,研究人員對(duì)隨機(jī)選擇的96個(gè)缺口進(jìn)行了Sanger測(cè)序,驗(yàn)證了這一方法的可靠性。

 

在這一研究中,單分子測(cè)序技術(shù)幫助研究者們獲得了很好的結(jié)果,大大提高了基因組的完整性,也降低了后續(xù)實(shí)驗(yàn)和分析的難度,遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

 

研究人員對(duì)于含有大基因組的脊椎動(dòng)物(虎皮鸚鵡基因組大小1.2G、黑子白眉猴2.8G)只進(jìn)行了低深度的測(cè)序(4.4-6.8×)就能較好的改善其基因組完整性,說(shuō)明PacBio測(cè)序技術(shù)在大型基因組組裝領(lǐng)域具有強(qiáng)大的功能和應(yīng)用潛力。

 

該項(xiàng)目還在繼續(xù)進(jìn)行中,研究人員將會(huì)不斷的改進(jìn)組裝方法,提高基因組缺口的填補(bǔ)效率。目前,他們正在用這一方法對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的基因組進(jìn)行升級(jí)。

 


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