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單分子測序助力髓母細胞瘤外顯子組測序研究

日期:2012-08-30 07:55:59

PacBio第三代測序技術De novo測序、Target測序以及DNA Modification等領域的應用越來越廣泛,發揮的作用也越來越不可替代。而Broad研究院的科學家們更證明, PacBio RS不僅可以作為基因組研究手段,而且也是極好的基因分型、變異驗證與重復實驗的平臺(第三代測序:單分子測序在基因分型與突變驗證中的應用)。

 

最近Nature雜志發表了一項關于髓母細胞瘤外顯子組測序的研究,在該研究中,麻省理工和哈佛大學醫學院的科學家們利用PacBio平臺成功對Illumina Hiseq2000外顯子測序數據中的變異位點進行了驗證分析。

 

科學家們首先用外顯子捕獲平臺結合illumina Hiseq2000完成了對92例髓母細胞瘤患者病灶/正常對的測序,分析出多個可能的點突變位點,然后利用PacBio平臺對48個外顯子的PCR擴增產物進行驗證分析,最終確認了12個與髓母細胞瘤相關的變異,其中在RNA解旋酶基因DDX3X上的突變是以前從未發現的,為這種疾病的基礎研究和診斷提供了新的Marker。此外,科學家們對PacBio驗證數據與Hiseq2000數據的比對分析也證實,雖然PacBio單分測序容易產生較多的indel錯誤,但是其中大部分都是隨機性的,可以通過軟件進行修正。

 

“盡管PacBio SMRT測序方法有著比較高的indel錯誤率,但是利用這個技術可以非常容易的對CTDNEP1基因中的2bp deletion突變與其他隨機indel突變進行區分和識別”Illumina Solexa平臺產生的測序數據多是150bp左右的短片段,需要利用復雜的生物信息學分析手段對數據進行過濾、定位、組裝等分析。而且測序片段過短容易產生定位錯誤等問題,依賴PCR的測序方式也會不可避免的引入系統性測序誤差從而產生較多的假陽性。因此,一般需要利用另一種準確度更高的方法對其產生的變異數據進行交叉驗證。Sequenom質譜法和Sanger測序方法無疑是驗證的金標準,不過質譜法無法探尋未知位點,Sanger測序通量低又容易引入人為誤差。PacBio RS測序技術具有單分子的分辨率,不引入PCR過程,其CCS測序模式所產生的數據準確度非常高,可以對基因組中的低頻變異進行高效的釋讀,而且單分子測序的讀長長,可以尋找除已知位點以外的其他漏檢稀有突變,有效彌補SequenomSanger方法的缺陷。

 


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