Nature methods:原位RNA成像技術(shù)(二)
日期:2012-08-02 08:28:49
觀測RNA可為研究人員帶來許多新的認識。存在于特殊細胞以及這些細胞特殊位點中的RNA可以揭示潛藏在差別背后的機制。在癌癥和其他疾病中,RNA轉(zhuǎn)錄物有時會被發(fā)現(xiàn)存在于錯誤的地方。“這就是為什么大家會對RNA的定位感興趣的原因,然而RNA成像一直是一個挑戰(zhàn),”威爾康乃爾醫(yī)學(xué)院從事RNA調(diào)控研究的Samie Jaffrey說。
上接:Nature methods:原位RNA成像技術(shù)(一)
van Oudenaarden利用RNA FISH在小鼠腸冰凍切片上顯示了作為三種類型干細胞標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物在隱窩中的分布。腸隱窩常被用于研究再生和分化。利用原位RNA,可以快速挑選出大量的標(biāo)記物,組合觀測它們看看哪些獨特地識別了不同的細胞類型;用熒光蛋白標(biāo)記完成同樣的事情將是不太可能或不切實際的。van Oudenaarden.說:“無需遺傳修飾任何東西,你就可能獲得大量的進展。這相當(dāng)?shù)娜菀住N覀冮_玩笑說我們甚至不是生物化學(xué)家。”他說難的是設(shè)計成像系統(tǒng)和相應(yīng)的軟件。
第一個普遍應(yīng)用的RNA FISH探針是利用質(zhì)粒來生成反義RNA,其摻入的修飾核苷酸結(jié)合到了隨后可以被標(biāo)記的抗體上。阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的Robert Singer實驗室構(gòu)建出了另一種方法,用酶將熒光核苷酸類似物摻入到長雙鏈DNA分子。他們后來改良了這一技術(shù)利用幾組更小的合成DNA探針,每種探針大約50個核苷酸長,標(biāo)記著一些小分子熒光基團。
這種方法被van Oudenaarden的前博士后Arjun Raj進一步改良,他和新澤西醫(yī)學(xué)與牙科大學(xué)的Sanjay Tyagi設(shè)計出了更短的用于RNA FISH的寡核苷酸。這一系統(tǒng)利用數(shù)組約50種左右的探針,每種靶向轉(zhuǎn)錄物不同的部分。這些探針大約20個核苷酸長,用單個熒光基團修飾,更易于穿透細胞,相比于長探針制造更便宜更快速。然而,這種策略不能靶向短于約800個核苷酸的轉(zhuǎn)錄物,因為較少標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物很難看見。
Tyagi說利用更短的、逐個衍生的探針在固定細胞中生成RNA標(biāo)記更易于處理。“這是一個簡單的步驟可以解決大問題。由于寡核苷酸合成已經(jīng)變?yōu)樽詣踊憧梢栽?/SPAN>96孔板中生成寡核苷酸。”他補充說更多更小的探針提供了其他的利益。例如,一種探針的結(jié)合松解了轉(zhuǎn)錄物使得其他的探針更易于結(jié)合。并且并不是每個探針都需要是完美的,“你得到的是所有或大多數(shù)探針結(jié)合的信號,非不是一個或兩個錯誤結(jié)合的信號。”
Biosearch Technologies公司在去年9月推出了短的逐個標(biāo)記的探針Stellaris FISH。在研究人員在線輸入他們需要的轉(zhuǎn)錄物的序列后,公司的軟件會設(shè)計出數(shù)組多達48種探針來標(biāo)記它。Biosearch提供8種熒光基團選擇,從藍色到紅色,研究人員也可以購買為標(biāo)記的衍生探針,自己添加熒光基團。例如,van Oudenaarden將特異的基團附著到了波譜的紅色端,從而可以與藍色的核及綠色標(biāo)記的蛋白一并成像。Tyagi在同一套探針內(nèi)利用兩種不同的基團檢測了RNA加工事件,例如選擇性剪接形式。相似的方法可以鑒別融合基因。
Biosearch Technologies 公司企業(yè)發(fā)展部主任Marc Beal 說5納摩爾的混合定制寡核苷酸的標(biāo)準定價為575美元,足夠進行500-2000次反應(yīng)。Beal說該系統(tǒng)可以與各種熒光顯微鏡包括廣野顯微鏡和共聚焦顯微鏡一起使用,可用于冰凍、石蠟包埋組織樣品以及培養(yǎng)細胞。采用油浸透鏡可將“RNA點”放大60-100倍。Biosearch也正在開發(fā)一種可自動分析的專利成像系統(tǒng)。