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Your Good Partner in Biology Research

第三代測序的希望與陷阱

日期:2012-07-27 08:42:23

去年4月當美國太平洋生物科學公司Pacific Biosciences ( PacBio)宣布它將開始銷售其商業PacBio RS系統時,該公司預計第三代測序產品的發售將“立馬擴展DNA測序在諸如癌癥研究、病原體檢測和農業等領域的應用”。不同于市場上的第二代系統,PacBio RS系統能夠實現單分子實時測序反應,在一天內生成結果。此外,跨越幾千個DNA堿基的長序列讀取將使從頭測序成為可能,通過跨越重復區域可簡化序列組裝,并增進對拷貝數變異的檢測。由于不需要DNA擴增,這一系統將減少基因組覆蓋度中的某些人為假象(artifact)和偏差。

 

然而一年多過去了,現在看來研究人員對采用第三代測序技術一直保持慎重。為何?其中一個缺點就是錯誤率相對較高。盡管通過環形共有序列(CCS),包括多次測序較短模板,可以獲得高準確度,PacBio RS儀器生成了平均不到85%核苷酸準確度的單次讀取?!斑@些測序讀取的高錯誤率已經被視為這一技術的主要限制,”國家生物防御分析與對策中心基因組學研究人員Adam Phillippy說。

 

為了解決這一問題,馬里蘭大學國家生物防衛分析和反制中心的Adam Phillippy及同事們開發了一種新的融合技術將第二代和第三代測序技術結合到一起生成了近乎完全準確的長讀取,這一成果報道在71日的《自然生物技術》(Nature Biotechnology)雜志上。將這一技術應用到鸚鵡基因組,通過首先繪制短讀序列,計算高度準確的融合共有序列,校正了個別的長讀序列。短讀和PacBio RS CCS是通過454 Illumina測序儀生成,長單次讀取是通過PacBio RS生成?!拔覀冮_發了首個能夠校正和組裝PacBio RS單分子序列讀取的算法,并證實PacBio RS技術的高錯誤率可以設法得到控制,從而大大改善基因組和轉錄組的組裝,”Phillippy說。

 

和平共存?

 

但是仍有許多的工作要做。例如,軟件開發商需要更多時間來趕上新儀器。Phillippy 說:“第三代測序儀正在生成一種全新類型的測序數據。過去5年或更長時間以來算法開發幾乎完全集中于高通量、高準確度的短讀數據。將軟件開發過程轉向一個新焦點還需要相當長的時間。”Phillippy的算法是朝著這一正確方向邁出的一步,因為校正的讀取可以利用現有無法處理高錯誤率的生物信息工具來進行分析。

 

該技術還需要改善其可靠性、通量及成本才能具有競爭力。Phillippy說:“從454 Illumina技術引入到被廣泛接受,并將Sanger測序推至小角色之前,也存在相似的兩至三年的滯后。”

 

Pacific Biosciences正處于改善儀器通量及延伸讀取長度的進程中。公司產品管理總監Edwin Hauw說:“系統硬件本身并沒有改變,但我們正在改善化學和軟件?!蹦壳?,該系統非常適用于研究微生物基因組,但它的通量限制了對更大基因組的研究?!皩τ谀承盟某杀靖甙?,因此對人類基因組或其他大型基因組采用針對性測序是當下最佳的策略,”Hauw說。

 

一旦這些障礙被克服,新技術將使研究人員能夠深入了解許多與拷貝數變異和其他不容易用第二代測序技術研究的大型結構變異相關的疾病,例如癌癥、自閉癥和染色體疾病。長單分子測序也可以揭示對于包含在基因組非編碼內含子和基因內區域中的“無用DNA”的認識,這些“無用DNA”被認為起著重要的調控作用,但由于無法正確組裝而沒有得到廣泛研究。

 

但第三代測序技術不太可能很快取代之前的技術。最終,對于測序技術的選擇將取決于特異的研究問題。例如種群研究需要高深度測序,人類單核苷酸多態性調查或表達研究等仍然最好用第二代技術開展研究以非常低的成本生成大量的數據?!爸钡降谌夹g能夠與這種每個堿基的成本相稱,其在讀長尤其重要的應用例如基因組組裝或結構變異研究中將會受到限制。我期望第二代和第三代技術將可以和平共存直至產生另一個巨變,”Phillippy說。

 


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