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一種更為精確的基因組編輯方法

日期:2012-05-25 08:16:28

來自首爾大學的研究人員近日在《Genome Research》上介紹了一種精確的基因組改造方法,只在靶位點實現位點特異的基因組修飾,而不會引入不想要的插入缺失。這種方法使用的是鋅指切口酶nickase),而不是通常所說的鋅指核酸酶。

 

目前,基因治療領域還存在許多挑戰,從導入到預防免疫反應。然而,最基本的挑戰在于,如何用新鏈來取代現有的DNA鏈,即定向突變。鋅指核酸酶是基因組改造的強大工具,但它依賴DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接修復(NHEJ),此過程容易出錯,在靶位點和脫靶(off-target)位點隨機產生小的插入或缺失(indel)。

 

韓國首爾大學的Jin-Soo Kim解釋道:“基因組中通常有許多潛在的脫靶位點,因為人類基因天生是重復的。如果您意外在那些脫靶位點引入突變,則可能導致癌癥或疾病,因此那些脫靶突變值得關注。”

 

于是,Kim和他的同事開發出了切口酶,這是一種每次切開單鏈DNA,引入新遺傳物質的酶。由于切口酶只切割單鏈,而不是像標準核酸酶那樣切割雙鏈,故不想要的切口可由細胞內部的單鏈斷裂修復機制快速修復。

 

研究小組利用Fok1核酸結構域開發出切口酶,但經過修飾,讓它只引起單鏈斷裂。他們將其放入人胚腎細胞,來檢驗切口酶的活性。如果它成功將新的DNA整合到細胞,則細胞會表達螢光素酶基因。

 

盡管其他研究小組最近也開發出自己的切口酶,但Kim的實驗室是第一個研究切口酶對脫靶突變的作用。Kim表示:“我們的數據清晰表明,使用這種方法檢測不到脫靶突變。”

 

他們也發現了切口酶的缺點,即在靶位點上的效率略低于核酸酶。這可能是由于單鏈DNA斷裂引發的同源重組的效率低于雙鏈DNA斷裂引發的同源重組。他們認為,用戶應仔細評估切口酶和核酸酶在特定應用上的優勢和劣勢。

 

由于核酸酶介導的同源重組更加高效,故核酸酶仍然是傳統基因knockoutknockin實驗的理想工具。對于干細胞研究和基因治療等比較關心脫靶突變的應用,切口酶帶來的精確基因組編輯可能更理想。

 

研究小組計劃下一步研究單鏈斷裂修復中關鍵基因的作用,以便提高切口酶的效率。Kim認為:“核酸酶已經存在了幾十年,并經過優化。切口酶才出現了幾個月,因此我們仍需要時間來提高效率。”

 


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