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ELISA的質(zhì)量控制問題(一)

日期:2011-08-24 08:42:12

1949年美國College of American Pathologists(簡稱CAP)首先開始研究臨床實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制(簡稱質(zhì)控)問題,美國學(xué)者LeveryJenning1950年發(fā)表第一篇關(guān)于使用質(zhì)控圖的實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控,臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控工作正式拉序幕。

70年代,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制進(jìn)入一個(gè)新的階段--全面質(zhì)量管理,推行Good Laboratory Parctice(簡稱GLP)。進(jìn)入80年代末期,GLP的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生了,發(fā)展到"認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室"管理階段。

全面質(zhì)量管理的宗旨在于預(yù)防差錯(cuò)的產(chǎn)生。質(zhì)控圖的統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的目的是檢出差錯(cuò)。統(tǒng)計(jì)學(xué)的實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控是全面質(zhì)量管理中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

本章節(jié)主要介紹免疫學(xué)檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法。因?yàn)?/SPAN>ELISA是目前臨床上最常用的一種免疫學(xué)檢驗(yàn)方法,就以ELISA檢驗(yàn)為例,介紹一下有關(guān)問題。

衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心免疫質(zhì)控室從1988年開始在全國范圍內(nèi)開展乙肝標(biāo)志物檢驗(yàn)的質(zhì)量評價(jià)活動(dòng),一直采用這一套質(zhì)量評價(jià)方法,并在實(shí)踐中不斷實(shí)踐、提高和完善,希望能找出一條適合中國國情的,行之有效的質(zhì)量管理的道路。

一、基本概念

(一)質(zhì)量控制(Quaility Control,Q.C

質(zhì)量控制是監(jiān)視全過程,排除誤差,防止變化,維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個(gè)管理過程。這一過程是通過一個(gè)反饋環(huán)路進(jìn)行的。

1)確定控制的對象;

2)規(guī)定控制對象的標(biāo)準(zhǔn)(預(yù)期值);

3)制定或選擇控制方法和手段;

3)測量實(shí)際數(shù)據(jù);

4)比較或較對實(shí)際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異,并說明產(chǎn)生這一差異的原因。超出預(yù)定誤差范圍,報(bào)警系發(fā)出信號,反饋通道中斷。

5)采取行動(dòng),解決差異。恢復(fù)原狀(原標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài))的手段發(fā)揮作用。

質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進(jìn)行。質(zhì)控圖是把某一檢驗(yàn)的性能數(shù)據(jù)與所計(jì)算出來的預(yù)期的"控制限"進(jìn)行比較的圖。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進(jìn)行時(shí),按時(shí)間順序而抽選出來的,其目的是檢測檢驗(yàn)過程中變異的"可追查"性原因。"可追逆"性的誤差原因,是指除去隨機(jī)誤差以外的其他原因。"控制限"是通過統(tǒng)計(jì)計(jì)算出來的,在后我們將詳細(xì)介紹(見5.3.室內(nèi)質(zhì)控程序)。

(二)誤差

實(shí)驗(yàn)誤差分為三種:系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過失誤差。

系統(tǒng)誤差是指一系列測定結(jié)果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差,有明顯的規(guī)律性,可在一定條件下重復(fù)出現(xiàn),是可以通過質(zhì)控預(yù)防和校正的。

隨機(jī)誤差又稱偶然誤差,是一種偶然的、未能預(yù)料到的誤差,是難以避免和校正的誤差。檢驗(yàn)工作中隨機(jī)誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。

過失誤差是人為的責(zé)任誤差。通過加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理和開展質(zhì)量控制工作是可以避免的。

(三)正態(tài)分布及標(biāo)準(zhǔn)差

ELISA試驗(yàn)中,檢驗(yàn)同一樣本達(dá)20次以上時(shí),就會發(fā)現(xiàn)這組數(shù)據(jù)(指測定結(jié)果的吸光值)分布在均值兩側(cè),大部分集中在均值附近。如果以測定值為橫坐標(biāo),以出現(xiàn)的頻率為縱坐標(biāo)作圖,就可繪出一個(gè)呈鐘形的曲線圖。如圖5-1,鐘頂處為均值,其他值以均值為中心對稱分布,這就是正態(tài)分布。

正態(tài)曲線以下的面積稱概率,常用樣本的均數(shù)(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)來表示,其計(jì)算方法如下:

均值、標(biāo)準(zhǔn)差和概率的關(guān)系如下:

X±1SD,概率0.68 X±2SD,概率0.95 X±3SD,概率0.99

換言之,當(dāng)ELSIA檢測同一樣本達(dá)一定次數(shù)后所得的一組數(shù)據(jù),其中靠近均值(X)的±1SD范圍內(nèi)的數(shù)據(jù),占該組數(shù)據(jù)的68%,在X±2SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的95%,在X±3SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的99%。當(dāng)我們要求檢驗(yàn)結(jié)果在X±2SD范圍內(nèi)為合格時(shí),將有95%的數(shù)據(jù)可能合格。

(四) 真值

用確切的、最理想的決定性方法測得的值,稱為真值。真值一般是測不到的。通過可靠的決定性方法測出的值,稱為靶值,通常用靶值來表示真值的大小。

(五)準(zhǔn)確度(accuracy

是指測定結(jié)果與真值(或靶值)接近的程度。準(zhǔn)確度不能以數(shù)字表示,往往用不準(zhǔn)確度來衡量。測定結(jié)果與靶值的偏離程度稱為偏差,它表示該項(xiàng)檢驗(yàn)的不準(zhǔn)確度。

絕對偏差=檢驗(yàn)的均值-真值(或靶值)

相對偏差=絕對偏差真值÷(或靶值)×100%

(六) 精密度(Precision

是指對同一樣本重復(fù)測定時(shí),每次測定結(jié)果與平均值的接近程度,即重復(fù)測定值之間的符合程度。

(七)標(biāo)準(zhǔn)品

1、國際標(biāo)準(zhǔn)品 WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的,用肯定的、公認(rèn)的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測定的定值材料。

2、國際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的國際活性單位的材料。

3、參考標(biāo)準(zhǔn)血清 國家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料。可用于鑒定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。

(八) 臨床決定性水平(clinical decision leuel

當(dāng)某個(gè)被測物的濃度達(dá)到某一水平時(shí),臨床醫(yī)師必須采用醫(yī)療措施。被測物的這濃度稱為臨床決定性水平。

二、質(zhì)量控制血清

質(zhì)控血清是已有靶值的血清,在每次的常規(guī)檢驗(yàn)中加入一份或數(shù)份,通過所得結(jié)果來了解本次檢驗(yàn)的情況。質(zhì)控血清檢驗(yàn)的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi),就說明該檢驗(yàn)沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結(jié)果,提示該檢驗(yàn)不合格,應(yīng)尋找原因,糾正后,重檢待測標(biāo)本。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。

(一) 質(zhì)控血清的使用

衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心制備的乙肝標(biāo)志物質(zhì)控血清,可以在-20保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時(shí),應(yīng)先混勻,未用完部分可在4保存5天。不宜反復(fù)冰融或自行分裝。開展某項(xiàng)檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清,一般按3-6個(gè)月用量準(zhǔn)備。自制的不定值質(zhì)控血清,在一批質(zhì)控血清將用完之前,需準(zhǔn)備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定,較長期內(nèi)效價(jià)不變,其理化性質(zhì)應(yīng)與病人樣本相近,這樣才能有效地起到監(jiān)測作用。

(二)臨界值質(zhì)控血清

質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控血清定值,一般定在正常值與異常值交界點(diǎn)上,定性測定時(shí)處于弱陽性水平,稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨界值的制定,應(yīng)按臨床要求,為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽性的標(biāo)準(zhǔn)。 臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品和陰性對照品以外的第三個(gè)對照品,它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平,確保弱陽性反應(yīng)的標(biāo)本不漏檢。

(三)質(zhì)控血清的制備

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的條件,選用臨床中心提供的質(zhì)控血清,或按以下方法自己制備本室使用的質(zhì)控血清(以乙肝質(zhì)控血清為例)。

1 收集新鮮的無溶血、無黃疸、無細(xì)菌污染的陽性血清。

2 56加熱10小時(shí)來活。

3 離心或過濾除去沉淀。

4 10%的小牛血清或正常人血清(PBS緩沖液)將收集的血清稀釋至所需的濃度。如能用正常的人血清稀釋更好,因其成份更接近于檢測標(biāo)本。

5 抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安瓿,封口,20保存?zhèn)溆谩2豢煞磸?fù)凍融。被檢物要求檢出的水平常被認(rèn)為是質(zhì)控血清應(yīng)選擇的水平。如果該試驗(yàn)還有其它要求,則應(yīng)加所要求濃度的質(zhì)控物。

6 標(biāo)定含量。20-30次測定結(jié)果刪除>±2SD數(shù)據(jù)的均值作為靶值,并與已知定值血清對比測定。


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