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蛋白質相互作用分析的新策略

日期:2011-05-25 08:12:43

美國Dana-Farber癌癥研究所癌癥系統生物學中心(CCSB)的研究人員將PCR拼接與新一代測序結合起來,用于蛋白質的相互作用網絡分析。該研究成果近日發表在《Nature Methods》在線版上。

細胞中存在著成百上千個大分子的相互作用,它們介導的功能維持了正常的細胞活性。為了大規模確定多種生物中的相互作用,人們已經開發出多種高通量的方法,如酵母雙雜交系統。然而,目前的高通量蛋白相互作用組(interactome)的數據集質量雖高,但覆蓋度很低。對于人類而言,95%以上的相互作用組還有待定位。

酵母雙雜交系統等高通量定位方法的瓶頸在于確定相互作用的蛋白、DNA或RNA分子的身份。新一代測序技術的補充有望提高通量,同時降低成本。近幾年來,新一代測序廣泛應用在生物學的多個方面,但尚未應用在蛋白質的相互作用網絡定位,因為通過集體測序無法了解每個相互作用對的成員之間的關聯。

盡管“鳥槍法”測序能夠高效測定基因組和轉錄組,但新一代測序技術無法直接鑒定相互作用對。于是,Dana-Farber癌癥研究所Marc Vidal領導的研究小組將PCR拼接(PCR stitching)與新一代測序結合起來,開發出一種大規模并行定位相互作用組的策略(Stitch-seq),并在高通量酵母雙雜交系統中檢驗了這種策略。

他們通過PCR將編碼相互作用對雜交蛋白的開放閱讀框(ORF)或cDNA擴增出來,并通過Sanger或新一代測序來鑒定。X與DNA結合結構域融合(DB-X),Y與激活結構域融合(AD-Y)。當X和Y來源于配對PCR平板的記錄位置,它們可通過計算機重組,形成相互作用序列標簽(ISTs)。

作者提到,他們的策略使整體費用降低了近40%,并允許通量增加。隨著新一代測序技術的不斷改善,測序費用應當持續下降。作者在研究中選擇了454 GS FLX測序平臺。之所以選擇這個平臺,是因為454技術是新一代測序中讀長最長的,而82 bp的接頭長度要求平均讀長要超過100 bp,才能可靠鑒定相互作用序列標簽。

作者認為,Stitch-seq不僅適用于酵母雙雜交系統,還可擴展到其他類型的相互作用分析,改善相互作用組網絡定位的能力和范圍。


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