Life Technologies公司和劍橋大學(xué)Gurdon癌癥與發(fā)育生物學(xué)研究所的研究人員合作開發(fā)出一種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，用于研究細胞從內(nèi)細胞團發(fā)育成胚胎干細胞時的基因表達變化。

這種技術(shù)不僅可用于研究正常發(fā)育時單細胞水平發(fā)生的變化，也適用于研究疾病狀態(tài)如癌癥和神經(jīng)退行性疾病的變化，它發(fā)表在近期的《細胞•干細胞》雜志上。Life Technologies正將這種技術(shù)開發(fā)成一個試劑盒。

研究人員以去年一項發(fā)表在《自然方法學(xué)》上的研究為基礎(chǔ)，該研究在胚胎中采用了單分子RNA測序方法。Life Technologies分子生物學(xué)部門的首席科學(xué)家，文章的通訊作者Kaiqin Lao告訴《In Sequence》，在那項研究中的細胞大約比干細胞多50倍，而在目前這項研究中，作者們在只含有100 飛克（1飛克 = 10^-15克）mRNA的細胞上驗證了這種方法同樣可行。

Lao及他的研究小組在Life Technologies的SOLiD儀器上對不同發(fā)育階段的33個單細胞的轉(zhuǎn)錄組進行了測序，以便研究當細胞從小鼠胚泡的內(nèi)細胞團發(fā)育成多能胚胎干細胞時的基因表達變化。

研究人員首先確認了只有來自內(nèi)細胞團的細胞包含有可發(fā)育成胚胎干細胞所必需的基因。然后，他們分析了在細胞發(fā)育成胚胎干細胞過程中五個不同階段的單個細胞。他們的目標是研究細胞發(fā)育時基因表達如何改變，并找出同一發(fā)育階段不同細胞之間的基因表達差異。

劍橋大學(xué)的研究人員利用Life Technologies開發(fā)的引物來捕獲mRNA，并將其轉(zhuǎn)化成cDNA，隨后擴增。然后Life Technologies的研究人員以此開展測序。

Life Technologies的研究小組從每個細胞中獲得了三千萬-四千萬個讀數(shù)，Lao認為這足夠研究中的分析使用。“如果你想要查看剪接變體，那么兩千萬個讀取就太低了。四千萬個是你的目標。”

在他們測序的胚胎干細胞階段的12個細胞中，他們檢測到大約65%的已知轉(zhuǎn)錄本，Lao認為這很有可能是發(fā)育早期階段的基因表達程度。

Lao表示，他正在努力改進這種方法，公司將開發(fā)一個試劑盒，用于“低起始量”的轉(zhuǎn)錄組測序，但目前還沒有上市日期。

首先，Life Technologies的研究小組必須優(yōu)化操作步驟，以便能夠捕獲每個轉(zhuǎn)錄本的全長。目前，用于分離mRNA的引物偏向轉(zhuǎn)錄本的3’端，因此對于長轉(zhuǎn)錄本來說缺少5’端。在這個特定研究中，這并不是問題，但對于想研究轉(zhuǎn)錄起始位點的研究人員來說，方法必須改進。

Lao表示，他們能夠捕獲最多3 kb的轉(zhuǎn)錄本，或者說轉(zhuǎn)錄本的60%。他正在使用不同的酶和試劑，努力將長度擴大至10 kb。他認為這將是這項技術(shù)有待克服的最大技術(shù)障礙。“擴大至10 kb需要一切都準確無誤，”他這樣表示。

他表示傾向于讓這種方法成為鏈特異的，并利用一個帶有條形碼的96孔板來實現(xiàn)，這樣來自96個不同細胞的RNA就能一次收集并測序。Lao認為那兩個改進都不太難，目前已經(jīng)有一種方案讓方法成為鏈特異的，不過未在本次研究中使用。

利用這種技術(shù)，研究人員可以展示當細胞發(fā)育時基因表達是如何改變的。他們還鑒別出兩類看起來負責(zé)調(diào)控多能性的microRNA，以及似乎在調(diào)控發(fā)育中起作用的選擇性剪接事件。

作者們將胚胎干細胞的轉(zhuǎn)錄組與來自內(nèi)細胞團和外胚層細胞的轉(zhuǎn)錄組進行了比較。他們發(fā)現(xiàn)了細胞處于不同階段時在分子特征上的清晰差異。具體地說，他們發(fā)現(xiàn)2475個基因在內(nèi)細胞團階段和胚胎干細胞階段的表達存在4倍以上的變化，另外大約2362個基因存在0.25倍以下的變化。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了2110個基因在外胚層和干細胞階段存在4倍以上的變化，而1170個基因存在0.25倍以下的變化。

比較同一階段不同細胞之間的表達水平，他們發(fā)現(xiàn)中等表達水平的基因比高表達水平的基因有著更高的可變性。

冷泉港實驗室的博士后研究人員Nick Navin認為這個結(jié)果彰顯了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的力量，他曾使用單細胞全基因組測序來研究腫瘤異質(zhì)性(IS 5/18/2010)。他認為：“他們清晰表明在某一特定階段，細胞與細胞之間多個基因的表達往往不同。如果他們一直在研究細胞群體，那么有著不同表達水平的稀有細胞將會錯過。”

研究人員還發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細胞階段，與細胞命運相關(guān)聯(lián)的基因已經(jīng)變得豐富。“這表明已經(jīng)有一些分化。一些細胞已經(jīng)開始走向它們的譜系。”Navin這樣說。

他還談到了一個特別有趣的發(fā)現(xiàn)，就是作者們發(fā)現(xiàn)當ICM細胞發(fā)育時表達的轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體存在很大變化，包括胚胎干細胞中缺失的128個轉(zhuǎn)錄變異體，以及169個在ICM中不表達而在ESC中表達的轉(zhuǎn)錄本。

Gurdon研究所生理學(xué)與生殖方面的教授，文章的另一位通訊作者Azim Surani通過電子郵件告訴《In Sequence》，研究結(jié)果提示“在胚胎發(fā)育的過程中，對選擇性剪接的調(diào)控可能對建立和調(diào)控單個細胞中的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。”

最后，作者們鑒定出兩類miRNA，一類促進分化，而另一類抑制分化。Surani表示，兩組miRNA可能共同作用，從而維持多能狀態(tài)。他說“這兩組miRNA也許可以讓胚胎干細胞對不同的信號分子和培養(yǎng)條件作出正確的響應(yīng)。”

他表示，他的研究小組目前正在使用單分子RNA測序來研究早期生殖細胞發(fā)育過程中的基因表達動力學(xué)，以幫助了解表觀遺傳的重編程事件。他認為這種技術(shù)對分析細胞群體中的細胞異質(zhì)性很有用，這個群體包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、造血和其它干細胞，以及腫瘤細胞。它在鑒定癌癥干細胞的存在時特別有用。

Navin也同意這種技術(shù)在研究癌癥時特別有用，因為腫瘤的異質(zhì)性。他說：“將它與全基因組結(jié)構(gòu)變化相結(jié)合，將是了解腫瘤亞群的一種非常強大的方法。”