攜帶多個(gè)目的基因的重組腺病毒的制備
日期：2010-06-25 11:10:10
目的基因的獲取：
（1）特定細(xì)胞表達(dá)的目的基因：提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增；
（2）載體中含有的目的基因：酶切或PCR獲取；
（3）融合蛋白基因：根據(jù)需求，進(jìn)行PCR合成目的基因；
2、穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建：
（1）攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建：通過酶切、連接的方式得到，一般采用的是pShuttle-cmv載體；
（2）攜帶多個(gè)目的基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建：如同時(shí)表達(dá)兩個(gè)目的基因，可通過IRES將兩個(gè)目的基因相連；
（3）攜帶干涉序列shRNA的穿梭質(zhì)粒：首先將H1啟動(dòng)子構(gòu)建到pShuttle質(zhì)粒上，然后將目的基因克隆到H1啟動(dòng)子下游；
3、重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建：
攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒線性化后與Adeasy-1共轉(zhuǎn)BJ5183感受態(tài)細(xì)胞（電轉(zhuǎn)），篩選得到重組腺病毒質(zhì)粒，并經(jīng)PacI酶切鑒定：可見目的質(zhì)粒出現(xiàn)兩條條帶，分別為3.0kb或4.5kb和>23Kb兩條條帶。 將得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞，以便于保存。
4、重組腺病毒的制備：
將PacI酶切線性化的高純度高濃度重組腺病毒質(zhì)粒，以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，7～10天出現(xiàn)噬斑，待完全病變后，收集細(xì)胞和上清，于-70℃保存。
5、重組腺病毒的鑒定
在基因水平，提取腺病毒基因組DNA，采用目的基因的引物，PCR擴(kuò)增病毒基因組DNA；并采用相應(yīng)的引物，檢測(cè)是否含有復(fù)制型腺病毒。
在蛋白水平，分泌蛋白，采用ELISA檢測(cè)目的基因的表達(dá)；膜蛋白采用流式方法進(jìn)行檢測(cè)；其他蛋白采用Western-blot方法進(jìn)行檢測(cè)。
6、病毒擴(kuò)增及純化：
根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要擴(kuò)增重組腺病毒（細(xì)胞實(shí)驗(yàn)20～40皿；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)60～80皿），并采用氯化銫密度梯度離心法進(jìn)行純化，純化得到的病毒用10％甘油保存。
7、病毒滴度測(cè)定：
紫外分光光度法檢測(cè)病毒的OD260和280值：根據(jù)OD260nm可推算病毒的顆粒滴度； OD260nm/OD280nm代表病毒的純度。
同時(shí)，采用快速CPE和TCID50測(cè)定病毒的感染滴度。 
