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染色體步移技術的改進

日期:2010-04-26 16:57:35

染色體步移(genome walking)是一種克隆方法,可以獲得與已知序列相鄰的未知基因組區域。在過去20年研究人員開發出多種染色體步移的方法,大體可分為三類:反向PCR,連接介導的PCR和隨機引物PCR。最近,韓國生物科學技術研究所(KRIBB)的一個研究小組對傳統的連接介導PCR方法進行了改進,文章發表在近期的《Analytical Biochemistry》上。

KRIBB的首席科學家宋正勛(Jung-Hoon Sohn)認為染色體步移是一種很有效的基因克隆方法。“一旦你得到部分的基因組片段,你就能通過PCR不斷獲得側翼片段。如果不使用PCR,從DNA文庫中克隆不但單調,而且困難。”

然而基于PCR的染色體步移方法面臨著多種問題:特異性和效率低,步移距離短,且方法復雜。宋博士解釋道,盡管PCR一般需要兩個起始位點,而連接介導的PCR染色體步移只需要單個起始位點。通過與缺乏5’端磷酸基團的框(cassette)連接,產生了第二個起始位點。這種方法的問題在于往往非特異擴增了許多DNA片段。宋博士及其同事開發的“模板鎖定(template-blocking)”方法降低了這種非特異的擴增。

在這種新方法中,研究人員用雙脫氧NTP(ddNTP)填補了限制性酶消化的基因組片段的3’-OH,并與正確設計的框連接。這樣,側翼伴有框的基因組DNA片段就作為靶基因擴增的模板,擴增引物分別為基因特異的引物和框引物。基因組DNA的末端被ddNTP鎖定,從而大大降低了非特異性擴增,并產生了簡單快速的染色體步移。宋博士稱:“模板鎖定的PCR顯示出高特異性。它既不需要特殊設計的引物,也不需要巢式PCR。”

研究人員通過克隆畢赤酵母的一個PGK1新啟動子和青霉菌的兩個纖維素酶新基因,來檢驗了這種模板鎖定PCR。這兩種生物的完整基因組序列目前都還沒有。

宋博士解釋道:“真菌纖維素酶對于降解纖維素生物質產生糖和生物能量非常重要。我們從腐爛的木頭中分離出這種真菌,用于新纖維素酶的克隆。它只是模板鎖定PCR的一個例子,說明在未知基因組信息的情況下,從微生物中克隆基因也很簡單。”

對于基因組測序已經完成的少數物種(如人、小鼠、線蟲、水稻、擬南芥等)來說,可以輕松地從數據庫中找到已知序列的側翼序列。但是,對于大多數生物而言,在不了解它們的基因組序列以前,想要知道一個已知區域兩側的DNA序列,只能采用染色體步移技術。

盡管全基因組測序技術正在迅猛發展,獲得多個物種的全基因組序列變得更加容易,但宋認為染色體步移的改善對于實驗室日常工作仍很關鍵,因為很多種感興趣的生物都未完成基因組測序,或只完成了部分。


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