遺傳篩查是研究哺乳動物細胞中基因功能的強大工具。將基因擾動與細胞表型相關聯，目前主要有兩種方法：芯片篩查和混合篩查。芯片篩查能揭示高分辨率的表型，但其通量有限且價格不菲。混合篩查則能夠快速篩查數千個擾動，效率高，擴展性好，但它不能揭示每個擾動的詳細表型。

如今，四項近期發表的研究為遺傳篩查帶來了第三種選擇，將芯片篩查和混合篩查的優勢相結合。三個獨立的研究小組開發出CROP-seq、CRISP-seq和Perturb-seq技術，它們利用CRISPR-Cas9系統在單個樣品中平行生成數千個基因擾動。之后利用單細胞RNA-Seq，同時測定每個細胞的擾動和表型。

這些新方法將豐富的表型信息與每個特定擾動相關聯，實現了大規模的單細胞轉錄譜分析。奧地利科學院的Christoph Bock表示：“這些方法建立了一種新的高通量篩查范例，結合了混合篩查與芯片篩查的主要優點，從而有助于我們更有效地探索新穎的生物學機制。”

Perturb-seq

在《Cell》雜志上發表的兩項研究中，加州大學舊金山分校的Jonathan Weissman和Broad研究院的Aviv Regev介紹了一種稱為Perturb-seq的新方法。Broad的團隊使用這種方法分析了20萬個細胞，重點在調控樹突狀細胞反應的轉錄因子。Perturb-seq準確鑒定了受擾動影響的單個基因靶點、基因特征和細胞狀態。

Weissman實驗室的博士后研究員、其中一篇文章的共同第一作者Britt Adamson表示：“Perturb-seq填補了當前功能基因組學研究的一大缺口。它提供了一種革命性的工具，能夠快速系統地剖析細胞中所有主要的轉錄通路。”

這種基于CRISPR-Cas9的方法依賴設計的向導RNA來實現靶向的基因組編輯。據作者介紹，主要的瓶頸在于開發細胞條形碼策略，以便準確捕獲哪個向導RNA在特定細胞中表達，以及哪個基因被擾動。他們的研究十分了不起，在擴大單細胞數量的同時，還能夠將擾動準確分配到每個細胞。

CRISP-seq和CROP-seq

在同一期的《Cell》雜志上，以色列魏茨曼研究所的Ido Amit團隊應用新方法CRISP-seq來探索先天免疫的調控回路。他們采集了數萬個受擾動的細胞，并鑒定了控制骨髓細胞分化及其對病原體反應的調控網絡。據作者介紹，結果表明CRISP-seq可以作為一種通用方法來探索哺乳動物細胞的調控，同時有望用于未來免疫細胞的改造。

在這幾篇文章發布后不久，Bock及其團隊在《Nature Methods》上介紹了一種新方法：CRISPR液滴測序（簡稱CROP-seq）。這種方法結合了四大關鍵要素：向導RNA載體，高通量的單細胞RNA-seq檢測，分配單細胞轉錄組的計算管道，以及分析和解釋向導RNA誘導的轉錄圖譜的生物信息學方法。與Perturb-seq和CRISP-seq相比，CROP-seq的優勢在于能直接讀取向導RNA，這大大簡化了單細胞CRISPR篩查，使其與混合篩查中的標準克隆方案完全兼容。

盡管這種方法目前僅支持單細胞RNA-seq，但單細胞多組學方案很快將投入使用。在未來的研究中，Bock及其團隊打算利用CROP-seq來開展癌癥研究，探索表觀基因組編輯的潛力。他們的計劃是在正常細胞中引入特定的表觀遺傳缺陷，將它們轉化成癌細胞，從而證明表觀遺傳在癌癥中的作用。同時，他們也有意將癌細胞重編程為惡性程度較低的細胞，希望找出那些調節細胞命運而不是殺死所有細胞的潛在治療方法。

機遇與挑戰

與之前開發的方法相比，這些新方法具有明顯的優勢。首先，它們提供了一種通用型檢測，可同時捕獲各種表型，而不依賴生物標志物。對于之前那些難以開展混合篩查的應用，它們能夠輕松勝任。其次，這些方法還能充分利用CRISPR-Cas9系統的靈活性，比如基因沉默（CRISPRi）或激活（CRISPRa）。

從臨床的角度來看，這些方法有望直接應用在包含數萬個細胞的活檢樣本上。“將單細胞CRISPR技術用在復雜的異質組織上，這將是令人興奮的，如原發性腫瘤，其中每種細胞類型對治療藥物都可能有不同的反應。通過單細胞CRISPR測序，我們現在能檢測同一腫瘤中的不同細胞是否依賴不同的基因來應對化療，”Bock說。

當然，這些方法也有一些實際的問題。據Bock介紹，一個問題是單細胞RNA-seq的成本太高，使得目前的篩查規模限制在1000個目標基因。不過正如Dixit所指出的，這一成本有望隨著時間的推移而下降。“在過去幾年，單個細胞的測序成本下降了100倍，在未來幾年可能還會下降10-100倍，”Dixit說。目前，開展全基因組范圍篩查的成本大約是10萬到100萬美元，具體取決于你想要哪些細節。

在技術層面，Weissman及其團隊正在努力簡化和擴展他們的方法。通過改進一些方面，他們相信能提高效率，并降低成本。他們還計劃繼續改進計算方法，以便更好地了解數據。“盡管這項技術還很年輕，但若擴展到全基因組規模的功能基因組學，并沒有內在的限制，”Weissman說。