CRISPR重要成果：CRISPR敲除治療疾病

日期：2017-03-16 08:54:41

美國國立衛生研究院眼科研究所的一組研究人員報道了最新成果：他們通過一種病毒載體直接向眼睛輸送了基于CRISPR-as9的治療元件，成功在視網膜變性小鼠中阻止了視網膜色素變性。這一研究成果公布在3月14日的Nature Communications雜志上，文章的通訊作者是美國國立衛生研究院眼科研究所的吳志堅研究員（Zhijian Wu，音譯）。

視網膜色素變性（Retinitis pigmentosa）是一種具有明顯遺傳傾向的慢性、進行性視網膜色素上皮和光感受器的變性疾病，發病率大約為四千分之一，會引發視網膜變性，并最終導致失明。這種遺傳性疾病已與超過60個基因（和超過3,000個突變）相關聯，因此為基因治療增加了難度，最新這項研究的結果表明，基于基因編輯的更廣泛治療方法可用于靶向視網膜色素變性中的多個遺傳缺陷。

在視網膜的眼后部組織中有兩種類型的細胞，能將光轉換成電信號發給大腦，視桿光感受器能在昏暗的光線下產生視覺，而視錐光感受器則能在光照條件下實現色彩視覺和觀察。遺傳突變主要影響前者，導致夜盲癥，就像是視網膜色素變性患者看到的那樣。不過由于視桿光感受器也會為視錐光感受器提供重要的結構和營養支持，因此視桿光感受器障礙或死亡會導致視錐光感受器變性和失明。

為此眼科研究所眼部基因治療中心主任吳志堅等人設計了一種CRISPR單導向RNA（sgRNA），靶向視網膜轉錄因子：神經視網膜亮氨酸拉鏈（Neural retina leucine zipper，Nrl），Nrl能調控視網膜發育過程中特殊視桿細胞的命運，并維持成熟視網膜內的視桿細胞。研究小組將Nrl-sgRNA和Cas9內切核酸酶通過兩個單獨的腺相關病毒（AAV）載體，直接遞送到小鼠視網膜上。他們指出，這種AAV載體的優點就是能維持非分裂細胞（例如視網膜細胞）中長期基因表達的能力。

來自華盛頓大學醫學院的神經病理學家Joseph Corbo（未參與該項研究）表示，“目前缺乏針對視網膜變性的有效治療，特別是缺乏這種疾病不同遺傳變異的治療，這項研究是我們領域中非常令人激動的一項重要進步”。Corbo實驗室是第一個發現靶向Nrl可以保留小鼠視錐細胞功能的實驗室。

在最新研究中，研究人員利用基于Cre的重組系統，發現敲除Nrl可以將視桿細胞部分轉換類似視錐細胞，防止視桿細胞的死亡以及視網膜色素變性中二級視錐細胞的死亡。

吳志堅研究員表示，“我們的想法不是將視桿細胞轉變成真正的視錐細胞，而是令它們獲得一些視錐細胞的特征，從而能低空引發其最終死亡的突變影響。”

但Cre重組方法并不使用于人體，因此研究人員轉向了CRISPR系統。 “這項新工作獲得了兩個方面的進步：作者采用了了一種AAV介導的CRISPR-Cas9遞送系統，可以應用于人類患者，并且他們指出了這種策略可以在多種視網膜變性模型中起作用。”

研究組首先將實驗治療載體注射到2周齡野生型小鼠的視網膜中，然后觀察小鼠在三至四個月內的變化。與注射對照載體的小鼠相比，接受治療的小鼠Nr1表達量降低。在注射后第6周，治療小鼠視桿細胞出現了下調的視桿細胞基因，以及上調的視錐細胞基因。同時研究人員也指出，這種治療不會對視錐細胞產生任何有害作用。

這種完整消除Nrl的效果令人印象深刻，也是這項工作的一個關鍵成果。

然后，研究組在三種不同的視網膜色素變性小鼠模型上檢測了載體，其中包括視紫紅質基因中表達顯性人類突變的模型，之后再觀察幾個月后小鼠的變化，結果表明在所有三種情況下，治療小鼠保留了更多的視桿細胞，阻止了視桿細胞和視錐細胞的死亡。

去年年初，美國Cedars-Sinai醫學中心的研究人員利用CRISPR-Cas9刪除視網膜色素變性的遺傳突變，他們將這個系統注入年輕的實驗室大鼠體內，這種大鼠已被改造成模擬一種遺傳性視網膜色素變性，稱為常染色體顯性遺傳，這涉及到該基因的突變。單次注射后，通過視動反射測量——包括轉動頭部響應運動不同亮度的條紋，研究人員發現，與對照組動物相比，這些大鼠的視力變得更好。華人女學者用CRISPR技術改善遺傳性失明之后，哥倫比亞大學醫學中心（CUMC）等處的Stephen Tsang等人也利用一種基于CRISPR的方法來修復人類和小鼠視網膜色素變性相關的突變，而他們利用的是視網膜色素變性患者的皮膚樣品制備干細胞。由于病人來源的干細胞仍攜帶有致病基因突變，因此，該研究團隊使用CRISPR來修復有缺陷的基因。干細胞可被轉化為健康的視網膜細胞，并移植到同一患者中來治療視力喪失。研究人員靶定了視網膜色素變性最常見的一個變體，它是由RGPR基因中一個單一錯誤引起的。RGPR的組成——其中包含許多重復和緊密結合的核苷酸對，使它成為一個很難編輯的基因。