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Science子刊:微量小RNA深度測序技術分析

日期:2016-06-15 09:08:11

 610日,國際著名學術期刊Science子刊Science Advances在線發表了中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所國家蛋白質科學中心(上海)吳立剛研究組與上海市計劃生育研究所施惠娟研究組合作的最新研究成果“Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos”,該研究優化建立了適用于微量樣本的小RNA深度測序(deep sequencing)文庫構建方法,并系統解析了小鼠早期胚胎發育過程中小RNA的動態變化及其生物學功能。

 

目前小RNA深度測序的文庫構建通常要幾百納克(ng)總RNA,研究配子和胚胎等難以大量獲取的生物學樣品中的小RNA表達譜較為困難。該研究通過優化基于連接反應的小RNA文庫構建方法,使得總RNA用量降低了幾十倍,僅需要10納克總RNA即可在Illumina測序儀上實現對小RNA的深度測序,為研究配子、胚胎和各種干細胞中的小RNA提供了重要技術支撐。該研究利用優化的方法系統解析了小鼠卵子到受精后8細胞胚胎發育過程中的小RNA動態變化,發現小鼠卵子和早期胚胎主要包含三類小RNAendo-siRNApiRNAmiRNA。受精卵中的這三類小RNA絕大多數來源于卵子,由精子帶入卵子的小RNA不足幾百分之一。隨著胚胎的發育,母源endo-siRNApiRNA逐漸被緩慢降解。而母源miRNA的降解較快,主要發生在胚胎2細胞期前后,其中有近20%miRNA 3’末端被加上了一個或四個腺苷酸(A),其降解速率與未被腺苷酸化的miRNA相比明顯減緩,推測可能3’末端腺苷酸化發揮了保護作用,使某些miRNA免于在母型至合子型轉化中被快速清除。合子中新表達的miRNA最早出現在受精卵第一次分裂前,并隨著胚胎的發育持續被激活表達,特別是進化保守的miRNA的表達量迅速上升。研究人員進一步結合小鼠早期胚胎發育的轉錄組數據進行分析,發現miRNA在卵子到胚胎2細胞期中幾乎沒有降解靶基因mRNA的功能,而在4-8細胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能開始逐步恢復,并對合子激活表達的基因有明顯的靶向抑制作用。以上研究不僅揭示了小鼠早期胚胎發育中miRNA的表達和降解規律,還發現了miRNA對靶基因的調控活性隨著胚胎發育而被動態調控的現象,對于理解miRNA在早期胚胎發育中的功能和機制具有重要意義。

 

楊其元、林濟民、劉淼為該論文共同第一作者,李逸平課題組的李榮紅對深度測序數據分析做出了重要貢獻,吳立剛、施惠娟為共同通訊作者。該工作的數據收集工作得到生化與細胞所公共技術服務中心分子生物學技術平臺的技術支持,經費上得到了國家科技部、國家基金委和上海市科委的支持。

 

小鼠卵細胞和早期胚胎中微量小RNA深度測序方法原理及其測序結果。(A)微量小RNA深度測序cDNA文庫構建流程圖。(B)小鼠卵細胞以及早期胚胎發育各個時期的樣本。(C)不同樣本中小RNA的組成及長度分布圖。小鼠CD4+ T細胞(CD4)是體細胞對照。

 


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