CRISPR領(lǐng)銜科學(xué)家探討CRISPR遺傳篩選
日期:2016-06-07 08:49:09
基因編輯,尤其是CRISPR/Cas9系統(tǒng),從某種意義上來說就像是一輛正在生產(chǎn)的閃亮新車,在構(gòu)建主要框架的同時也開始啟動,而且還準(zhǔn)備開始一路飚車。
自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因編輯之后,這個前途光明的技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到了許多研究領(lǐng)域,而且隨著技術(shù)的改良,越來越多的研究團(tuán)隊利用CRISPR進(jìn)行大規(guī)模的遺傳篩選,比如用于識別導(dǎo)致癌癥抵抗治療的突變,或者加速藥物靶標(biāo)評估。RNA干擾,相比于CRISPR/Cas9 在遺傳篩選方面的作用,無論是效率和特異性方面,目前都難以望其項背了。
同時,譬如MD安德森癌癥中心等處的研究人員也開始進(jìn)一步了解CRISPR/Cas9的特性和局限性,了解它到底能做些什么,比如分析人類細(xì)胞系。CRISPR/Cas9 工具箱不斷的擴(kuò)大,Broad研究院的張鋒等人也開始利用Cas9結(jié)合到基因組上,停止或者加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。他們對于CRISPR/Cas9在遺傳篩選方面的作用,有何看法呢?
張鋒研究組曾在“Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity”這篇文章中,探討了從化膿性鏈球菌中改變了組成Cas9酶的1400個氨基酸中的3個氨基酸,從而將基因編輯中脫靶效應(yīng)降低到了幾乎無法檢測的水平的可能性。當(dāng)RNA 與DNA 不是那么配對的時候,Cas9內(nèi)切酶會誘導(dǎo)脫靶突變,導(dǎo)致這無法成為臨床試驗中的精確基因編輯。
為了能容納下Cas9蛋白,DNA鏈需要分開,張鋒研究組進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)在Cas9蛋白位點的負(fù)電荷非靶標(biāo)DNA上有一個合適的正電荷凹槽。“我們認(rèn)為如果能中和部分正電荷,就能消弱穩(wěn)定性,從而能Cas9更具特異性,”張鋒說。
他們利用已知定位在特殊脫靶位點上的導(dǎo)向RNAs來進(jìn)行了這個方法的實驗,研究組構(gòu)建出了Cas9的32個單突變,然后將每個突變通過EMX1基因有效,但容易出現(xiàn)錯誤的導(dǎo)向RNA,靶向EMX1。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中五個能完成EMX1基因的基因編輯,但是會十倍比率的減少脫靶位點的切割,之后研究人員又嘗試?yán)?span lang="EN-US">Cas9突變?nèi)デ袛嗔硗庖粋€基因:VEGFA,這種基因已知能在兩個之前識別的脫靶位點上進(jìn)行切割。雖然所有的Cas9突變都減少了脫靶效應(yīng),但是研究人員認(rèn)為他們應(yīng)該結(jié)合這些突變,讓Cas9更加特異性。因此他們利用三點突變體(triple-point mutations)產(chǎn)生了兩個不同的突變,發(fā)現(xiàn)“我們能完成靶向激活,并進(jìn)一步減少脫靶活性,”張鋒說。