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中山大學(xué)等開發(fā)RNA編輯新工具

日期:2016-06-01 09:37:44

 CRISPR-Cas9系統(tǒng)使用一段引導(dǎo)RNA(其與Cas9蛋白結(jié)合起來才能發(fā)揮作用)來靶定一段DNA,并裂解雙鏈DNA。這一現(xiàn)象提出了一個問題:由一個Dicer結(jié)合RNA元件和一段反義RNA組成的一種人造小RNAasRNA),是否也能用來誘導(dǎo)Dicer處理和降解一段特定的RNA呢?

 

為此,525日在國際腫瘤期刊《Oncotarget》發(fā)表的一項研究中,來自中山大學(xué)、深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院、汕頭大學(xué)等處的研究人員開發(fā)出一種新的方法——命名為DICERi,用于基因沉默或RNA編輯。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的張勇教授、深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院的Weiren HuangZhiming Cai是這篇論文的共同通訊作者。

 

作為細菌和古生菌的適應(yīng)性免疫防御,CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成為一種常規(guī)和強大的工具,用于基因組編輯,特別是II型細菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)。CRISPR位點是由一系列的重復(fù)序列組成,被“間隔區(qū)”序列分開。“間隔區(qū)”序列與噬菌體的基因組以及其他易變的遺傳元件相匹配。重復(fù)間隔陣列被轉(zhuǎn)錄并處理以生成一段小crRNA,來識別靶序列。重復(fù)間隔區(qū)陣列兩側(cè)的元件是編碼Cas9CRISPR/Cas9基因,即使用crRNA來引導(dǎo)靶位點裂解的一段雙鏈DNA核酸內(nèi)切酶。

 

在靶位點下游的一段序列基序——稱為protospacer-adjacent motif (PAM),對于裂解是至關(guān)重要的。CrRNACas9的裝載,也需要一段小的tracrRNA,它被反轉(zhuǎn)錄成crRNA前體和RNase III。現(xiàn)在,科學(xué)家們已經(jīng)成功地將crRNAtracrRNA融合,來產(chǎn)生小的引導(dǎo)RNA,以簡化這個系統(tǒng)。

 

RNA干擾RNAi)已經(jīng)對我們關(guān)于“遺傳信息表達的調(diào)控機制”的觀點,提出了挑戰(zhàn)。它表明,在真核生物中,蛋白質(zhì)和RNA分子都能調(diào)控基因的表達。首先,在細胞核中,Drosha將一段50-70nt的莖環(huán)前體(pre-miRNA)從一段初級轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)上切除。然后,細胞核轉(zhuǎn)運受體exportin-5,將pre-miRNA運輸?shù)郊毎|(zhì)中。隨后,pre-miRNADicer裂解,從而生成了一段短的19-23nt的復(fù)式結(jié)構(gòu),在3’端具有2nt的懸突,5’末端被磷酸化。在短的復(fù)式結(jié)構(gòu)被加載到一個多元核酸酶RISC上之后,一條鏈被釋放和降解,另一條鏈仍然被切斷為一段引導(dǎo)序列,來指導(dǎo)RISC破壞互補性的信使RNAmRNA)。

 

受到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的角色模型的啟發(fā),該研究小組想知道,是否我們能夠引入一段人造的小RNAasRNA,由Dicer結(jié)合RNA元件和一段反義RNA組成),來誘導(dǎo)Dicer處理和降解一段特定的RNA,就如同CRISPR/Cas9系統(tǒng)中用引導(dǎo)RNA來誘導(dǎo)Cas9裂解靶序列。

 

該研究小組開發(fā)出一種新方法,使用一段低聚物RNA作為一個蛋白質(zhì)結(jié)合RNA元件,來誘導(dǎo)Dicer降解靶RNA。首先,他們選擇MALAT-1作為靶基因,并構(gòu)建了一個asRNA表達載體。然后,他們測量了這些裝置對表達水平和表型變化的影響,例如細胞增殖、細胞遷移和細胞凋亡。

 

研究結(jié)果表明,與陰性對照相比,這種新方法能顯著抑制靶基因的表達水平以及功能。接下來,該研究小組共轉(zhuǎn)染了靶定DicershRNA和對抗MALAT-1asRNA,以確認抑制作用是由Dcier誘導(dǎo)的。DNA編輯或RNA編輯都已經(jīng)廣泛用于生物學(xué)和治療學(xué)目的。它們能夠特異性地激活或抑制DNARNA,以調(diào)節(jié)基因網(wǎng)絡(luò)。

 

在這項研究中,研究人員重新改造了Dcier,并向RNA編輯添加了另一個成員。不同實驗方法的結(jié)果證實,這種假設(shè)是正確的。然而,進一步的工作——比如改善反義RNA和靶RNA之間的特定結(jié)合,應(yīng)該能夠使這種新方法更具有適用性。

 

總而言之,這種新的方法是用于RNA編輯的一種新型、有效的工具,可能對于指導(dǎo)和重新連接基因網(wǎng)絡(luò),具有廣泛的用途。

 

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