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Cell重要突破:首次利用CRISPR技術追蹤RNA

日期:2016-03-18 08:57:01

 基因編輯工具CRISPR-Cas9現在可作為一種靈活、易使用的方法,靶向及追蹤活細胞中RNA的活動。發布在317日《細胞》(Cell)雜志上的這一新方法,有可能最終可用于研究廣泛的疾病相關RNA過程,及操控基因轉錄進行疾病建模。

 

論文的資深作者、加州大學圣地亞哥分校的Gene Yeo說:“我們才剛剛開始利用CRISPR技術看到基因組工程改造的影響,但許多的疾病包括癌癥和自閉癥都與另一種基本生物學分子RNA出現問題有關聯。未來這項研究工作的進一步發展可以使研究人員能夠檢測RNA加工的其他特征,或支持一些治療方法來糾正致病RNA行為。”

 

其他一些改造蛋白質來識別某些RNA序列的嘗試一直缺乏特異性,且需要完成耗費勞力的程序操作。同時,稱作為分子信標(molecular beacon)的短核酸僅限于成像應用,難于傳送到細胞中(熒光定量PCR選擇多 )。稱作核酸適配體(aptamer)的蛋白質結合分子能夠在活細胞中追蹤RNA,但它們能夠識別的RNA序列數量有限。

 

為了克服這些方法的局限性。Yeo和他的研究小組轉而借助了CRISPR-Cas9,眾所周知這一技術能夠在各種生物中精確地編輯幾乎所有的目的基因組位點。CRISPR-Cas9技術的特異性依賴于單向導RNA(sgRNA)sgRNACas9酶形成的一種復合物可在靶DNA序列中生成突變。在這項新研究中,研究人員從幾個方面改造了CRISPR-Cas9系統,優化它用于RNA追蹤。

 

一種關鍵改造的靈感來自共同作者、加州大學伯克利分校Jennifer Doudna實驗室過去的研究。2014Doudna實驗室的成員就曾經重新改造過釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenesCas9在試管中結合并切割RNANature發布CRISPR重大突破:可編程的RNA編輯工具 )。Doudna研究小組還鑒別出了另一種由嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)生成的RNA靶向Cas酶。

 

基于Doudna的研究發現,他們設計出了一種叫做PAMmer的獨特短核酸,使得Cas9能夠在不損傷靶分子的情況下有效地識別RNA而非DNA。他們還利用了一種無催化活性的Cas9酶避免了切割轉錄組,并用一種熒光蛋白標記Cas9在顯微鏡下監測了RNA的活動。最后,他們利用一種優化的sgRNA改善了靶向RNA的效率。通過這些改造,這一技術能夠在活細胞中追蹤RNA,且不會改變RNA的豐度或翻譯蛋白的量。

 

研究人員證實,他們的方法可用于追蹤人類細胞中響應細胞應激的RNA活動。他們能夠顯像在應激顆粒(stress granule)中累積的特異RNA分子。應激顆粒是響應細胞應激由蛋白質與RNA組裝而成的胞質顆粒結構,其與諸如肌萎縮側索硬化癥等神經退行性疾病有關聯。

 

當前,Yeo和他的研究小組正在探索除RNA定位外,RNA靶向Cas9改變和檢測RNA加工其他特征的能力。未來進一步發展這種方法可以闡明與癌癥和脊髓性肌肉萎縮癥等神經退行性疾病,及脆性X染色體綜合征等神經發育疾病相關的功能失調的RNA過程。

 

論文的第一作者、加州大學圣地亞哥分校的David Nelles 說:“這一技術的一個潛在應用就是隨時間推移在病變神經元中追蹤RNA運輸,以鑒別出這些疾病的分子特征,支持開發出一些療法。正如CRISPR-Cas9使得所有使用基礎設備的科學家都能夠實現遺傳工程操縱一樣,RNA靶向Cas9可以支持無數其他的努力來研究RNA加工在疾病中的作用,或鑒別出逆轉RNA加工缺陷的藥物。”

 


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