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Cell子刊綜述:多能干細胞的基因組編輯

日期:2016-01-13 09:17:30

 具有敲除或突變等位基因的人類多能干細胞hPSCs),可以通過定制設計的核酸酶產生。轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)和成簇規律間隔短回文重復序列(CRISPR)-Cas9核酸酶,是編輯hPSC基因組最常用的技術。

 

16日,Cell子刊《Cell Stem Cell》在線發表了來自哈佛大學和麻省總醫院研究人員的一篇綜述文章,題為“Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions”。在這篇綜述文章中,研究人員簡單回顧了定制設計的核酸酶在hPSCs基因編輯中的應用,集中關注TALENsCRISPR/Cas9的實際應用。突出了每種方法的優缺點,并討論了實驗設計的理論和技術方面的考慮。

 

人類胚胎干細胞(hESCs)的分離和人類誘導多能干細胞(hiPSC重編程的發現,使干細胞生物學、體外疾病模型和藥物發現重新復興起來。在一般情況下,基于hPSC的疾病模型非常適合于研究遺傳變異。例如,研究通常將病人來源的hiPSCs——攜帶有導致疾病的基因突變,與(年齡相仿的)對照組衍生hiPSCs進行比較——通常分化為受影響的細胞類型,如神經細胞或肝細胞。這種疾病建模策略需要注意,分化的傾向和表型特性的可變性,即使在來自同一供體的hPSCs中。

 

不過,即使一個給定突變的細胞表型是強大的、高度滲透的,也可能由于無關hPSC細胞系遺傳背景中差異的混淆影響,而發生缺失。為了克服這一障礙,一種非常強大的方法是,使用定制設計的核酸內切酶,使研究人員能夠對內源性hPSC基因組序列進行精確和可編程的修飾。這種基因組工程戰略,對于研究人類生物學和疾病將是非常有價值的。

 

傳遞到細胞內之后,定制設計的核酸酶將特定的雙鏈斷裂(DSBs)引入DNA,可通過易出錯的非同源末端連接(NHEJ)或精確的同源指導修復(HDR),而得以修復。通過NHEJDSB修復,通常會導致靶位點中小的插入/缺失(indel)。這些缺失可造成移碼突變,從而導致蛋白編碼基因的功能性敲除。雙鏈DSBs將通過NHEJ修復,從而刪除完全插入的序列。精確的遺傳修飾(如核苷酸替換或刪除)是由外源DNA供體模板的共同傳遞完成的。

 

大多數的工程核酸酶包括一個可定制的、序列特異性的DNA結合結構域,與一段非特異性的DNA核酸內切酶結構域熔合。雖然自然發生的歸巢核酸內切酶或大范圍核酸酶已被成功用于基因組工程,但是它們在hPSCs基因組編輯中的應用,一直都是非常有限的。成功用于hPSCs基因組編輯的第一個定制設計、位點特異性內切酶,是鋅指核酸酶(ZFNs)。ZFNs的設計相對比較困難,它們的設計以及在實驗室中的構建,在技術上仍然具有挑戰性。

 

另一個定制設計的核酸內切酶是TALEN。像ZENs一樣,TALENs包括一段定制的TALE DNA結合結構域,與非特異性的Fokl核酸酶結構域熔合。TALEN介導的hPSCs基因組編輯,已被用于產生hPSC基因報告細胞系、基因的雙等位基因敲除以及點突變的修復和引入。

 

Cas9系統包含Cas9核酸酶和短的非編碼CRISPR RNA序列,稱為sgRNA。這些sgRNAs包含一段定制的20核苷酸序列,將共表達的Cas9核酸酶引導到sgRNA靶序列上,用以產生位點特異性的DSB

 

在這項綜述中,作者討論了TALEN-CRISPR/Cas9介導的基因組編輯程序用于hPSCs基因組編輯中,并可遵循一個通用的工作流程,并強調了所存在的問題、未預料到的困難和與之對應的解決方案。這篇綜述文章中所描述的許多基因編輯方法,已經在其他類型的細胞中得以驗證,但是只要有可能,就可以將它們應用于hPSCs

 


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