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基于PCR評估sgRNA特異性的方法

日期:2015-08-12 09:01:25

 CRISPR/Cas9已經成為一種通用的基因組工程工具,依賴于一個單導向RNAsgRNA)和Cas9酶進行基因組編輯。研究人員可以用簡單、快速和經濟的方法來產生sgRNAs,因此能夠在培養細胞、小鼠、斑馬魚和其他模型系統中進行靶向誘變。為了靶向效率,預先篩選sgRNAs,對于成功誘變和減少動物飼養成本,都是可取的。八月七日在國際學術期刊《Nucleic Acids Research》發表的一項研究中,來自美國國立衛生研究院的研究人員,提出了一種簡單、快速和具有成本效益的熒光PCR為基礎的方法——CRISPR Somatic Tissue Activity Test (CRISPR-STAT),來確定sgRNA的靶向特異性效率。

 

最近,利用鋅指核酸酶(ZFNs)、TAL效應物核酸酶(TALENs)和CRISPRs進行基因組編輯所取得的進展,已經使人們有可能在許多系統(包括斑馬魚)中進行靶向誘變。而靶向特異性的ZFNsTALENs組裝,由于設計、成本的限制和/或繁瑣的程序,具有很多局限性,CRISPR/Cas9需要設計一個引導RNAsgRNA),可以很低的成本快速地合成。

 

此外,CRISPR/Cas9的靶序列是靈活的,僅僅受到一個protospacer相鄰基序(PAM位點)的需要的限制。因此,快速設計和生成多個靶標的sgRNAs是簡單的。然而,所有的sgRNAs在產生靶位點突變的時候,并沒有表現出類似的活性水平。通過計算方法預測活性,對于所有應用程序可能是不可靠的,因為標準是來自于有限的、背景特定的數據。因此,對任何給定sgRNA活性水平進行快速的實驗驗證,是必不可少的。

 

目前,已經開發了許多方法來評估靶向核酸酶(包括CRISPR/Cas9)的活性。確定體細胞活性水平的“金標準”方法,是通過對靶區域進行PCR,然后對大量克隆進行測序。雖然這種方法在確定活性水平方面,具有很高的靈敏度和特異性,但是它是昂貴的,并且是勞動密集型的。簡單的錯配試驗,如高分辨率熔解分析HRMA)和DNA裂解(通過T7核酸內切酶),在某些生物(如斑馬魚)中具有很差的特異性,基因組中具有高頻的多態性,可造成假陽性的結果。

 

同樣,限制性片段長度多態性分析受到靶位點選擇的限制。Yu等人開發的基于定量PCR反應的程序,是檢測體細胞活性的一種可行方法。然而,我們可能很難設計與預測切割位點重疊的穩定引物。最近兩種以序列為基礎的方法——稱為TIDECRISPR-GA,被用于細胞培養實驗中sgRNA活性的定量評價。然而,這兩種方法都有其應用的局限性。目前還沒有任何一種檢測,可以很容易地用于所有模型系統。

 

在這項研究中,研究人員證明了CRISPR-STAT在斑馬魚中用作預篩選方法來評估sgRNA特異性的效用。通過將CRISPR-STAT評估與產生sgRNA的的無克隆方法相結合,任何實驗室應該都可以在感興趣的基因中產生突變,并在飼養動物之前確證打靶的有效性。研究人員建議,每個基因應該設計至少兩個sgRNA,并評估一小部分的注射胚胎。這種方法有利于成功的誘變,并最大限度地減少了動物飼養和首建動物篩選的時間和成本。

 

作為原理驗證,研究人員在斑馬魚中檢測了這種方法,他們用具有已知和不同種系傳遞效率的28sgRNA,分析了它們在注射胚胎中的體細胞活性。這些數據顯示,在注射胚胎的熒光PCR分析結果和種系傳遞效率之間,存在著強烈的正相關性。此外,這種方法非常敏感,足以評估多個基因打靶。雖然,該研究是利用CRISPR/Cas9和斑馬魚測試了這種方法,但是它也可以應用于其他動物模型系統,以及其他基因組靶向核酸酶。

 


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