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用CRISPR構建“自毀”型載體

日期:2015-04-01 09:21:14

 基因表達實驗可以揭示蛋白質的功能,不過要精確控制基因的表達還比較困難,特別是在合成生物學和基因治療領域。現在科學家們利用CRISPR技術構建出了一種新型載體,該載體在哺乳動物細胞中產生蛋白合成脈沖之后就會降解,由此控制蛋白質的表達量和表達時間。這項研究發表在Nucleic Acids Research雜志上。

 

為了實現精確可控的基因遞送,德克薩斯大學Leonidas Bleris決定帶領研究團隊設計半衰期短的質粒,“我們很快決定采用CRISPR-Cas9技術,”他說。

 

研究人員設計的質粒載體攜帶有目的基因、Cas9核酸酶和引導Cas9剪切的gRNA。當這樣的質粒進入細胞之后,就會生產這三種蛋白。隨后gRNA引導Cas9酶去切掉質粒,抑制進一步的蛋白生產并降解載體。而已經表達的蛋白最終會被細胞分解掉。

 

研究人員在這個質粒中添加了方便檢測的熒光蛋白mKate2,還選擇了兩種在人類基因組中脫靶最少的gRNA。由于mKate2半衰期較長,研究人員在它的C端加上了加速其降解的氨基酸序列。研究顯示,質粒進入人類細胞后產生了明亮的熒光脈沖,熒光在七小時之后達到峰值,隨后慢慢衰退。

 

在證明了質粒的有效性之后,研究人員開始對這一系統進行微調。他們通過計算機模擬分析了載體量、mKate2穩定性、剪切復合體與靶點親和力所產生的影響,并在此基礎上構建了不同版本的遞送系統。“蛋白質穩定性和CRISPR系統的剪切效率,決定著蛋白的表達量和表達時間,”Bleris說。

 

研究人員建立了能夠滿足一系列遞送性能的載體文庫,包括不同的蛋白合成量和蛋白合成時間。除了提供基因治療所必須的精確控制,這些載體在合成生物學中也很有價值。“這一機制還可以用來實現無痕遞送,甚至保護知識產權,”他補充道。舉例來說,讓gRNA靶標遞送載體上的多個靶標,可以在引入治療性蛋白之后將載體完全降解,以保護載體上的專利序列。

 


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