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BioTechniques:從細菌和酵母中提取gDNA的簡便方法

日期:2015-03-12 08:48:47

 從微生物中提取基因組DNA,人們多采用異硫氰酸胍進行裂解,不過對于有些細菌而言,仍需要繁瑣的預處理。加拿大舍布魯克大學(Université de Sherbrooke)的研究人員開發出一種快速而經濟的gDNA提取方法,適用于各種濃度的細菌和酵母。這種新方法發表在《BioTechniques3月刊上。

 

為了加速微生物的檢測和分析,許多分子生物學技術都經過了優化,如PCR、質譜和測序。然而,DNA提取方法卻始終未見大的進展。異硫氰酸胍處理和硅膠柱的方法能夠從革蘭氏陰性菌中很好地提取DNA,但革蘭氏陽性菌或抗酸的細菌和酵母仍需要酶學或機械預處理。對于血液或尿液這種存在不同類型微生物的樣品而言,這很麻煩。

 

人們也嘗試了各種策略來增強異硫氰酸胍對微生物的裂解,包括機械法、酶學或化學處理。機械處理也許是最常用的方法,但可能將gDNA剪切成小的片段,限制PCR擴增子的量。對于含有不同類型微生物的樣品,這個問題就變得更加復雜,因為不同微生物可能需要不同的微珠和處理時間。酶學和化學裂解通常也是因微生物而異,往往更耗時。

 

在這項研究中,Laurie Vingataramin Eric H. Frost采用了一種稱為EtNa的新方法。它通過加熱乙醇堿性溶液而釋放出細菌和酵母中的單鏈DNA,關鍵是不同微生物的提取效率相似。當微生物的身份未知,或提取不得忽視或偏向特定微生物時,這種方法就很有用。

 

之前,Frost與同事開發出原型方法,提取出金黃色葡萄球菌的DNA。此次,VingataraminFrostEtNa方法進行了改良。它的具體過程是:在61%的乙醇、200 mM NaOH2.25 mM EDTA溶液中重懸細菌沉淀,并在80°C下加熱懸液10分鐘。釋放出的單鏈DNAssDNA)隨后沉淀在微量離心管中,重懸后用于PCREtNa crude)。或者,將加熱后的混合物上樣到QiaAmp DNA Mini Kit的純化柱中,以純化gDNAEtNa pure)。

 

研究人員以多種細菌和酵母為樣本,比較了EtNa方法及其他常用方法,包括QIAGENQiaAmp DNA Mini KitLife TechnologiesChargeSwitch gDNA Mini Kit。他們使用了100 μl樣本,其中包含107 rRNA當量的白色念珠菌,或108 rRNA當量的大腸桿菌或表皮葡萄球菌。結果表明,所有方法都成功提取了細菌DNA,但只有EtNaLiOAc-SDS成功提取出酵母中的gDNA

 

作者認為,他們開發出一種快速、經濟而可靠的裂解酵母和細菌的方法。EtNa試劑可用于臨床診斷或生物醫學研究中,在25分鐘內處理各種生物樣品。通過這種方法獲得的ssDNA可直接使用,或經過硅膠柱進一步純化。

 


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