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精確檢測CRISPR脫靶效應的新方法

日期:2015-01-23 08:43:57

 CRISPRTALENs作為新興的基因組編輯技術,雖然優(yōu)勢多多,但是仍然被脫靶效應所困擾。美國希望之城貝克曼研究所和浙江大學第一附屬醫(yī)院的研究人員開發(fā)出一種新策略,有望幫助人們檢測這種意想不到的結果。這項成果于本周在線發(fā)表于《Nature Biotechnology》雜志上。

 

CRISPRTALENs技術目前被廣泛應用于研究中,而將來更有望用于臨床,但脫靶效應的存在始終是個問題。因此,需要有效的方法來確認DNA切割是否在適當的位置。計算機算法和體外選擇都能夠用來篩查潛在的脫靶位點,但它們往往不能準確預測。

 

為了開發(fā)出一種更好的方法來檢測這兩種技術的脫靶效應,希望之城的研究人員Jiing-Kuan Yee及其同事使用了一種基于整合酶缺陷型慢病毒載體(IDLV)的技術。這項技術最初由德國癌癥研究中心的團隊開發(fā),來鑒定鋅指核酸酶(ZFN)的意外切割。

 

在非同源末端連接(NHEJ)的DNA修復過程中,線性的雙鏈IDLV基因組能夠優(yōu)先整合到雙鏈斷裂(DSB)中。根據之前發(fā)表的文章,這些IDLV能夠引入ZFN處理的細胞,標記DSB的位置。之后,利用線性擴增介導的PCR,可定位IDLV的整合位點,揭示IFN是否擊中目標位點。

 

受到這種方法的啟發(fā),Jiing-Kuan Yee將其修改后應用于CRISPRTALENs。“本質上是同一種方法,但我們利用一種不同的方法來產生DNA雙鏈斷裂,”Yee談道。

 

在他們的實驗中,Yee及其同事產生了靶定兩個基因的CRISPR/Cas9核酸酶和TALENs。這兩個基因分別是Wiskott-Aldrich綜合征(WAS)基因和酪氨酸氨基轉移酶(TAT)基因。它們突變時會引起疾病。

 

研究人員利用表達CRISPR/Cas9核酸酶或TALENs的質粒轉染HEK細胞,之后轉導了IDLV。這個IDLV攜帶的基因賦予了抗生素和嘌呤霉素的抗性。核酸酶形成DSB后,允許IDLV整合,使得耐受嘌呤霉素的克隆數量增加了兩到三倍。

 

對于CRISPR/Cas9TALEN處理過的細胞,研究人員在目標切割位點的60 bp內鑒定出成簇的IDLV整合位點(CLIS)。當他們尋找WASTAT基因以外的CLIS時,在TALEN處理的細胞中未找到脫靶位點,而在CRISPR/Cas9核酸酶中發(fā)現一些。之后他們利用芯片預測和深度測序來確定IDLV分析的靈敏度,發(fā)現它能夠檢測頻率低至1%的脫靶切割。

 

Yee認為,IDLV方法并非完美,因為它不能可靠檢測低頻率的脫靶位點,但強調這種方法的無偏向性。“這是一個生物學分析;它并非基于哪些可能是脫靶位點的預測,”他補充道。

 


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