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Nature Biotechnology:CRISPR脫靶的全基因組圖譜

日期:2014-12-17 10:00:37

 CRISPR-Cas是時下最熱門的基因編輯工具。日前,麻省總醫院(MGH)的研究團隊開發了在基因組范圍內檢測CRISPR脫靶效應的全新方法,GUIDE-seqGenome-wide Unbiased Indentification of DSBs Evaluated by Sequencing)。這一成果發表在十二月十六日的Nature Biotechnology雜志上。

 

“以往人們在檢測CRISPR-Cas核酸酶誘導的脫靶DNA斷裂時,往往事先假定脫靶位點與靶標位點相似。GUIDE-seq是首個不需要這樣做的方法,而且它相當靈敏,”這項研究的資深作者,哈佛醫學院的副教授J. Keith Joung說。“這對于評估CRISPR-Cas的臨床安全性非常重要。”

 

CRISPR-Cas RNA引導性核酸酶(RGN)通過斷開雙鏈DNA來引入遺傳學改變,RGN含有一個Cas核酸酶和一個與目標DNA序列互補的短RNA。去年Joung等人首次報告,當DNA片段與目標片段的差異在五個核苷酸以下,CRISPR-Cas RGN就會出現脫靶。這樣的脫靶突變會導致包括癌癥在內的副作用,鑒定并減少這些DSB是確保CRISPR臨床安全性的基礎。

 

研究人員利用一種短雙鏈寡核苷酸來標記CRISPR-Cas誘導的脫靶斷裂,測序這些標簽所在的基因組區域,就能夠確定脫靶突變的位置。研究表明,就算某個脫靶突變的出現頻率低至0.1%GUIDE-seq也能夠檢測得到。由于許多脫靶突變發生在與目標位點差異很大的地方,因此脫靶DSB的數量和位置是很難預測的。

 

現有工具主要是通過分析目標序列來預測脫靶突變,研究人員將這些工具與GUIDE-seq進行了比較。研究顯示,上述工具在預測已驗證的脫靶位點時比GUIDE-seq差很多,還會錯誤檢出實際上不被酶切的位點。此外,研究人員還對比了GUIDE-seqChIP-seq(檢測蛋白與DNA的結合),結果證明ChIP-seq并不是鑒定 CRISPR-Cas脫靶DSB的可靠方法。

 

GUIDE-seq也可以用來鑒定普通細胞中的DSB熱點區域,“之前有許多文章描述過人類細胞的基因組脆弱位點,”Joung說。“用GUIDE-seq鑒定這些位點,不需要事先添加藥物來增強斷裂。我們驚訝的發現,不同細胞系的DSB大多發生在不同的位置。我們的研究表明,GUIDE-seq可以成為在活細胞中研究和監控DNA修復的有用工具。”

 

Joung等人之前曾經發表文章指出,縮短引導RNA能夠顯著改善CRISPR-Cas的精確性,減少全基因組中的脫靶DSB。他們在這項新研究中用GUIDE-seq驗證了這個方法的有效性。

 

Joung希望GUIDE-seq日后可以用來鑒定其他基因編輯工具誘導的脫靶斷裂。他還認為,在未形成細胞系的細胞中檢測脫靶效應是很重要的,這樣的結果更貼近基因編輯工具在臨床上的作用機制。

 

GUIDE-seq是一個非常直觀的方法,我們打算在不久的將來把分析測序數據的軟件放到網站上,供非商業性質的研究人員使用,”Joung說,他已經為GUIDE-seq技術遞交了專利申請。

 


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