如何選擇合適的表達(dá)載體？
日期：2024-01-26 10:23:07
在生物醫(yī)學(xué)研究和許多其他領(lǐng)域，對(duì)重組蛋白的需求日益增長(zhǎng)。要生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，需要將蛋白質(zhì)編碼序列克隆到合適的表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。那么，表達(dá)載體究竟是什么呢？
簡(jiǎn)單地說(shuō)，表達(dá)載體是一種 DNA 分子，它攜帶特定基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，并利用細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制來(lái)生產(chǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)。表達(dá)載體允許外來(lái)基因在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)，經(jīng)過多年的發(fā)展，表達(dá)載體已成為一種成熟和流行的生物技術(shù)。
由于其功能，表達(dá)載體必須包含基因表達(dá)所必需的元素。眾所周知的元素包括強(qiáng)啟動(dòng)子或正常啟動(dòng)子、正確的翻譯啟動(dòng)序列（如核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）和啟動(dòng)密碼子）、終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止序列。此外，為了便于蛋白質(zhì)生產(chǎn)后的純化，表達(dá)載體通常帶有純化標(biāo)簽，將其添加到所需的蛋白質(zhì)序列中。最后，有些表達(dá)載體還帶有一些特殊的元素，例如對(duì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至關(guān)重要的元素。
說(shuō)到表達(dá)載體，就不得不提到克隆載體。從本質(zhì)上講，表達(dá)載體和克隆載體都是獨(dú)立于染色體的人工構(gòu)建的環(huán)狀 DNA 序列。通常，表達(dá)載體比克隆載體更復(fù)雜。克隆載體是指一種 DNA 分子，它能將外來(lái) DNA 帶入宿主細(xì)胞，在細(xì)胞中復(fù)制并產(chǎn)生目標(biāo)基因的多個(gè)拷貝。克隆載體包含自我復(fù)制的關(guān)鍵元件，但不攜帶蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控元件。相比之下，表達(dá)載體則同時(shí)包含這兩種元素。
目前，有多種蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可供選擇，如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此，有許多不同的表達(dá)載體可用于不同的表達(dá)系統(tǒng)。最常見的表達(dá)載體是質(zhì)粒和病毒。決定使用哪種載體取決于表達(dá)系統(tǒng)和許多其他因素。合適的表達(dá)載體有助于目標(biāo)蛋白質(zhì)的成功表達(dá)，必要時(shí)還有助于蛋白質(zhì)的純化。
在選擇表達(dá)載體時(shí)，最好牢記以下幾點(diǎn)：
1. 表達(dá)系統(tǒng)
你需要選擇一種表達(dá)系統(tǒng)專用的表達(dá)載體。在選擇表達(dá)載體之前，你應(yīng)該決定用哪種系統(tǒng)來(lái)表達(dá)你感興趣的蛋白質(zhì)。
2. 純化標(biāo)簽
如果想在表達(dá)后純化蛋白質(zhì)，表達(dá)載體可能會(huì)包含純化標(biāo)簽，如 His、Myc、FLAG 等。無(wú)論如何，是否需要 C 端或 N 端標(biāo)簽取決于實(shí)驗(yàn)的具體需要。
3. 目標(biāo)蛋白的應(yīng)用
根據(jù)目標(biāo)蛋白的下游應(yīng)用，表達(dá)載體可能含有其他標(biāo)簽和融合蛋白。有時(shí)，特定的標(biāo)簽有助于研究目標(biāo)蛋白的功能和蛋白與蛋白之間的相互作用。如果您想進(jìn)一步了解目標(biāo)蛋白的功能，標(biāo)簽和融合蛋白是有用的工具，可以讓您進(jìn)行 Western 印跡、免疫沉淀、pull-down 分析（體外蛋白結(jié)合分析）或其他實(shí)驗(yàn)。
4. 啟動(dòng)子的強(qiáng)度
啟動(dòng)子是 DNA 分子上與 RNA 聚合酶特異性結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子就像 "開關(guān) "一樣，決定基因的活性，控制基因表達(dá)的啟動(dòng)和程度。因此，啟動(dòng)子是構(gòu)建表達(dá)載體的必要條件。
在某些情況下，需要強(qiáng)啟動(dòng)子，而在另一些情況下，則需要普通啟動(dòng)子。例如，在酵母中，TEF1 是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，ADH1 是中等強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子，STE1 是弱組成型啟動(dòng)子。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子強(qiáng)度足以讓產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)大量積累，并能最大限度地減少對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的任何不利影響，如毒性。
5. 可選擇標(biāo)記
可選擇標(biāo)記是一種基因，它能賦予含有目標(biāo)基因（重組載體）的宿主細(xì)胞一種適合人工選擇的性狀。簡(jiǎn)而言之，可選擇標(biāo)記基因有助于識(shí)別和篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（接受重組載體的細(xì)胞）?？蛇x擇標(biāo)記的選擇取決于你使用的宿主細(xì)胞類型?？蛇x擇標(biāo)記通常是抗生素抗性基因。例如，β-內(nèi)酰胺酶賦予細(xì)菌宿主氨芐西林抗性。
6. 載體大小
這里唯一需要考慮的是，你是在處理大的 DNA 片段還是小的 DNA 片段。為了操作方便，載體必須是相對(duì)較小的分子。過大的載體可能會(huì)影響復(fù)制并導(dǎo)致穩(wěn)定性問題。通常，質(zhì)?？梢蕴幚黹L(zhǎng)達(dá) 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的質(zhì)粒可以處理更大的插入物。
任何蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的最終目標(biāo)都是生產(chǎn)出高質(zhì)高量的重組蛋白質(zhì)。表達(dá)載體有助于將外來(lái)遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并促進(jìn)目的蛋白質(zhì)的鑒定和純化。表達(dá)載體對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)起著決定性作用，因此選擇理想的表達(dá)載體意義重大。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，表達(dá)載體是一種 DNA 分子，它攜帶特定基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，并利用細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制來(lái)生產(chǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)。表達(dá)載體允許外來(lái)基因在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)，經(jīng)過多年的發(fā)展，表達(dá)載體已成為一種成熟和流行的生物技術(shù)。
由于其功能，表達(dá)載體必須包含基因表達(dá)所必需的元素。眾所周知的元素包括強(qiáng)啟動(dòng)子或正常啟動(dòng)子、正確的翻譯啟動(dòng)序列（如核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）和啟動(dòng)密碼子）、終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止序列。此外，為了便于蛋白質(zhì)生產(chǎn)后的純化，表達(dá)載體通常帶有純化標(biāo)簽，將其添加到所需的蛋白質(zhì)序列中。最后，有些表達(dá)載體還帶有一些特殊的元素，例如對(duì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至關(guān)重要的元素。
說(shuō)到表達(dá)載體，就不得不提到克隆載體。從本質(zhì)上講，表達(dá)載體和克隆載體都是獨(dú)立于染色體的人工構(gòu)建的環(huán)狀 DNA 序列。通常，表達(dá)載體比克隆載體更復(fù)雜。克隆載體是指一種 DNA 分子，它能將外來(lái) DNA 帶入宿主細(xì)胞，在細(xì)胞中復(fù)制并產(chǎn)生目標(biāo)基因的多個(gè)拷貝。克隆載體包含自我復(fù)制的關(guān)鍵元件，但不攜帶蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控元件。相比之下，表達(dá)載體則同時(shí)包含這兩種元素。
目前，有多種蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可供選擇，如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此，有許多不同的表達(dá)載體可用于不同的表達(dá)系統(tǒng)。最常見的表達(dá)載體是質(zhì)粒和病毒。決定使用哪種載體取決于表達(dá)系統(tǒng)和許多其他因素。合適的表達(dá)載體有助于目標(biāo)蛋白質(zhì)的成功表達(dá)，必要時(shí)還有助于蛋白質(zhì)的純化。
在選擇表達(dá)載體時(shí)，最好牢記以下幾點(diǎn)：
1. 表達(dá)系統(tǒng)
你需要選擇一種表達(dá)系統(tǒng)專用的表達(dá)載體。在選擇表達(dá)載體之前，你應(yīng)該決定用哪種系統(tǒng)來(lái)表達(dá)你感興趣的蛋白質(zhì)。
圖 1 用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體 pET22b-JT
圖 2 用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體 pPic9k-JT
2. 純化標(biāo)簽
如果想在表達(dá)后純化蛋白質(zhì)，表達(dá)載體可能會(huì)包含純化標(biāo)簽，如 His、Myc、FLAG 等。無(wú)論如何，是否需要 C 端或 N 端標(biāo)簽取決于實(shí)驗(yàn)的具體需要。
3. 目標(biāo)蛋白的應(yīng)用
根據(jù)目標(biāo)蛋白的下游應(yīng)用，表達(dá)載體可能含有其他標(biāo)簽和融合蛋白。有時(shí)，特定的標(biāo)簽有助于研究目標(biāo)蛋白的功能和蛋白與蛋白之間的相互作用。如果您想進(jìn)一步了解目標(biāo)蛋白的功能，標(biāo)簽和融合蛋白是有用的工具，可以讓您進(jìn)行 Western 印跡、免疫沉淀、pull-down 分析（體外蛋白結(jié)合分析）或其他實(shí)驗(yàn)。
4. 啟動(dòng)子的強(qiáng)度
啟動(dòng)子是 DNA 分子上與 RNA 聚合酶特異性結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子就像 "開關(guān) "一樣，決定基因的活性，控制基因表達(dá)的啟動(dòng)和程度。因此，啟動(dòng)子是構(gòu)建表達(dá)載體的必要條件。
在某些情況下，需要強(qiáng)啟動(dòng)子，而在另一些情況下，則需要普通啟動(dòng)子。例如，在酵母中，TEF1 是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，ADH1 是中等強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子，STE1 是弱組成型啟動(dòng)子。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子強(qiáng)度足以讓產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)大量積累，并能最大限度地減少對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的任何不利影響，如毒性。
5. 可選擇標(biāo)記
可選擇標(biāo)記是一種基因，它能賦予含有目標(biāo)基因（重組載體）的宿主細(xì)胞一種適合人工選擇的性狀。簡(jiǎn)而言之，可選擇標(biāo)記基因有助于識(shí)別和篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（接受重組載體的細(xì)胞）?？蛇x擇標(biāo)記的選擇取決于你使用的宿主細(xì)胞類型?？蛇x擇標(biāo)記通常是抗生素抗性基因。例如，β-內(nèi)酰胺酶賦予細(xì)菌宿主氨芐西林抗性。
6. 載體大小
這里唯一需要考慮的是，你是在處理大的 DNA 片段還是小的 DNA 片段。為了操作方便，載體必須是相對(duì)較小的分子。過大的載體可能會(huì)影響復(fù)制并導(dǎo)致穩(wěn)定性問題。通常，質(zhì)?？梢蕴幚黹L(zhǎng)達(dá) 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的質(zhì)粒可以處理更大的插入物。
任何蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的最終目標(biāo)都是生產(chǎn)出高質(zhì)高量的重組蛋白質(zhì)。表達(dá)載體有助于將外來(lái)遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并促進(jìn)目的蛋白質(zhì)的鑒定和純化。表達(dá)載體對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)起著決定性作用，因此選擇理想的表達(dá)載體意義重大。
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