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間接法elisa實驗步驟

日期:2023-08-25 14:53:14

以下是間接ELISA實驗的一般步驟:
 
    試樣和抗原準備:收集并準備待測的樣品,如血清、細胞上清液等。制備需要檢測的抗原(例如蛋白質),并將其吸附到96孔酶聯免疫吸附板(ELISA板)上。
 
    板預處理:將ELISA板加入適當的緩沖液,如PBS(磷酸鹽緩沖液),進行孵育以消除非特異性結合位點。
 
    樣品加入:將待測樣品加入孔中,通常會設置多個孔,包括陰性對照、陽性對照和空白對照。對于每個樣品,應設立重復的孔。
 
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    抗體結合:將與目標分子特異性抗體(一級抗體)加入到每個孔中,使其與樣品中的目標分子相結合。
 
    洗滌:用緩沖液反復洗滌孔中未結合的物質,以去除非特異性結合的物質。
 
    二級抗體結合:將與一級抗體來源物種不同的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的二級抗體加入到每個孔中,使其與一級抗體結合。
 
    再次洗滌:用緩沖液反復洗滌孔中未結合的二級抗體。
 
    底物添加:加入適當的底物,如TMB(3,3',5,5'-四甲基苯胺)或ABTS(2,2′-氨基丙基硫酸鹽),使其與酶發生反應產生可測定的信號。
 
    反應停止:加入停止液,如硫酸或磷酸酶停止劑,以停止底物的反應。
 
    信號檢測:使用酶標儀測量吸光度值,通常在450 nm波長下測量。吸光度值與目標分子的濃度成正比。
 
    通過對陰性和陽性對照的比較,以及與已知標準曲線的對照,可以計算出待測樣品中目標分子的濃度。
 
    需要根據實驗的具體要求和試劑盒的說明進行實驗條件的優化和操作步驟的調整。此外,實驗的結果也需要進行統計學分析和結果的解釋。
 
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