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重組蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中常出現(xiàn)包涵體表達(dá),如何解決這一問題?

日期:2025-04-02 13:22:00

    在原核表達(dá)系統(tǒng)中,重組蛋白出現(xiàn)包涵體表達(dá)的原因主要是蛋白折疊不正確、表達(dá)量過高以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境不適宜等。以下是一些解決包涵體問題的方法:
 
1.優(yōu)化表達(dá)條件
        降低誘導(dǎo)溫度:較低的溫度可以減緩蛋白合成速度,使蛋白有更多時(shí)間進(jìn)行正確折疊。一般可將誘導(dǎo)溫度從 37℃降至 16 - 25℃,具體溫度需通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。例如,在表達(dá)某些膜蛋白時(shí),將溫度控制在 20℃左右,可顯著減少包涵體的形成。
 
        減少誘導(dǎo)劑濃度:降低誘導(dǎo)劑(如 IPTG)的濃度,能降低重組蛋白的表達(dá)速度,有助于蛋白正確折疊??梢試L試將 IPTG 濃度從常規(guī)的 1 mM 降低至 0.1 - 0.5 mM。
 
        縮短誘導(dǎo)時(shí)間:適當(dāng)縮短誘導(dǎo)時(shí)間,避免蛋白過度表達(dá)而形成包涵體。誘導(dǎo)時(shí)間可從常規(guī)的 4 - 6 小時(shí)調(diào)整為 2 - 4 小時(shí),然后根據(jù)表達(dá)情況進(jìn)行優(yōu)化。
 
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2.優(yōu)化載體設(shè)計(jì)
        更換啟動(dòng)子:選擇較弱的啟動(dòng)子,使重組蛋白的表達(dá)水平適中,減少因表達(dá)量過高導(dǎo)致的包涵體形成。例如,將強(qiáng)啟動(dòng)子 T7 替換為相對(duì)較弱的 trc 或 lac 啟動(dòng)子。
 
        添加融合標(biāo)簽:在目標(biāo)蛋白的 N 端或 C 端添加融合標(biāo)簽,如谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)等。這些標(biāo)簽可以幫助蛋白正確折疊,增加蛋白的可溶性,同時(shí)也有利于后續(xù)的純化。
 
3.優(yōu)化宿主菌選擇
        選擇蛋白酶缺陷型菌株:某些宿主菌缺失了一些蛋白酶,能夠減少對(duì)重組蛋白的降解,使蛋白更易以可溶形式表達(dá)。如 BL21(DE3)pLysS 菌株,其含有溶菌酶基因,可降低細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶活性。
 
        選用分子伴侶輔助表達(dá)菌株:一些菌株如 Rosetta - gami B(DE3)pLysS 含有額外的分子伴侶和折疊酶,能幫助重組蛋白正確折疊,提高其可溶性。
 
4.改善培養(yǎng)條件
        優(yōu)化培養(yǎng)基成分:調(diào)整培養(yǎng)基中的碳源、氮源、微量元素等成分,以滿足重組蛋白表達(dá)和折疊的需求。例如,增加培養(yǎng)基中甘氨酸、脯氨酸等有助于蛋白折疊的氨基酸含量。
 
        控制 pH 值:維持合適的 pH 值有助于蛋白的正確折疊。一般來說,中性或略偏堿性的環(huán)境(pH 7.0 - 7.5)有利于大多數(shù)蛋白的表達(dá)和溶解。
 
5.包涵體的處理與復(fù)性
        包涵體的溶解:如果包涵體已經(jīng)形成,可以采用變性劑如尿素、鹽酸胍等將其溶解,使蛋白變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)。然后通過透析、稀釋等方法去除變性劑,使蛋白在體外重新折疊。
 
        復(fù)性條件優(yōu)化:復(fù)性過程中,需要優(yōu)化復(fù)性緩沖液的成分、溫度、pH 值等條件。例如,在復(fù)性緩沖液中加入氧化 - 還原試劑如谷胱甘肽,有助于蛋白二硫鍵的正確形成。同時(shí),緩慢降低變性劑濃度,避免蛋白重新聚集。

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