酵母三雜交技術實驗原理
日期:2023-07-13 16:13:57
酵母三雜交技術(yeast three-hybrid, Y3H)是常用的分子生物學實驗方法,用于研究蛋白質-蛋白質相互作用。它基于酵母細胞中的轉錄激活因子(transcriptional activator)的特性,通過檢測目標蛋白質與其他蛋白質的相互作用來篩選相互作用伴侶。
檢測報告基因的表達:
結果分析:
以下是酵母三雜交技術的實驗原理步驟:
構建酵母菌株:
構建一個酵母菌株,其中包含兩個可表達靶蛋白(target protein)和激活域(activation domain)的融合蛋白。這些融合蛋白通過基因工程方法將其編碼序列與適當的表達元件結合在一起。
酵母菌株中也含有一個報告基因(reporter gene),它的啟動子區域包含識別序列(binding site)。這個識別序列可以被激活域識別并結合。
共表達被檢測蛋白與靶蛋白:
引入第三個外源基因,這個基因編碼一個與被檢測蛋白(bait protein)相互作用的蛋白質(prey protein)。這個蛋白質會與靶蛋白形成復合物。
靶蛋白和激活域的融合蛋白同時表達,形成復合物。
檢測報告基因的表達:
如果被檢測蛋白與靶蛋白相互作用,它們會結合并促使激活域與識別序列結合,從而激活報告基因的轉錄和表達。
報告基因可以是編碼可觀察性標記物的基因,如熒光蛋白基因,或者編碼對酵母細胞存活有影響的基因。
結果分析:
觀察報告基因的表達情況,如果報告基因表達增加,則說明被檢測蛋白與靶蛋白發生相互作用。
可以通過熒光顯微鏡觀察細胞中的熒光信號,或者通過其他方法測定報告基因產物的量。
通過酵母三雜交技術,研究人員可以篩選出與目標蛋白質相互作用的結合伴侶蛋白,以進一步研究它們在細胞中的生物學功能和信號傳導途徑。
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