wb蛋白實(shí)驗(yàn)二抗的原理
日期：2023-06-14 13:36:46
WB（Western Blotting）免疫印跡法，常用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法。通過(guò)將蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，在聚丙烯酰胺凝膠上形成蛋白條帶，再將這些條帶轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管膜或硝酸纖維素膜上，然后使用特異性抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)。其中，二抗作為特異性檢測(cè)的關(guān)鍵之一，其原理如下：
1、二抗的來(lái)源
首先要了解的是，抗體分為多克隆抗體PAbs（polyclonal antibodies）和單克隆抗體MAbs（monoclonal antibodies）兩種。與PAbs相比，MAbs具有更高的親和力和特異性，并且價(jià)格更昂貴。因此，在實(shí)驗(yàn)中，一般會(huì)使用一種來(lái)自于另一種物種的抗體作為二抗來(lái)檢測(cè)主抗體。例如，當(dāng)主抗體是小鼠來(lái)源的MAb時(shí)，可以使用兔子或羊的PAbs作為二抗；反之亦然。
2、二抗的結(jié)構(gòu)
二抗的結(jié)構(gòu)與主抗體相同，都由免疫球蛋白Ig（immunoglobulin）分子組成。Ig分子包括兩個(gè)相同的輕鏈和兩個(gè)相同的重鏈，其中重鏈可分為α、β、γ、δ、ε和μ等亞型。在哺乳動(dòng)物中，IgG是最常用的二抗，因?yàn)樗哂懈叨鹊奶禺愋浴⒂H和力和穩(wěn)定性。
3、二抗的作用機(jī)制
二抗與主抗體結(jié)合的方式與主抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的方式相似，都是通過(guò)雙特異性的Fab段（抗原結(jié)合片段）實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)主抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合后，由于其Fc段（晶體片段）可以誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng)，因此會(huì)生成許多抗體，其中就包括以主抗體為抗原的抗體（即次級(jí)抗體）。這些次級(jí)抗體在某種程度上具有與主抗體相同的特異性和親和力，因此可以作為二抗來(lái)檢測(cè)主抗體。
4、二抗的選擇和使用
在選擇二抗時(shí)，需要考慮其與主抗體來(lái)源不同、亞型不同并且結(jié)合特異性高的特點(diǎn)。同時(shí)也要注意避免主抗體與二抗來(lái)源動(dòng)物的內(nèi)源性蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。在使用二抗時(shí)，需要將其稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋⑦M(jìn)行陰性對(duì)照（即只加主抗體或只加二抗）和陽(yáng)性對(duì)照（即加有目標(biāo)蛋白的細(xì)胞提取物），以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
二抗作為WB分析中的重要組成部分，可以在實(shí)驗(yàn)中大大提高檢測(cè)的敏感性和特異性，進(jìn)而為科研工作者提供更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
