膜蛋白酵母雙雜交技術原理和步驟
日期:2023-06-02 11:37:11
膜蛋白酵母雙雜交技術是一種常用的分子生物學實驗方法,用于研究蛋白質相互作用。該技術利用酵母細胞膜蛋白作為分子載體,將兩個目標蛋白質分別與酵母細胞膜蛋白的兩個域連接在一起,通過檢測酵母細胞的生長或轉錄激活來判斷目標蛋白質之間是否存在相互作用。以下是膜蛋白酵母雙雜交技術的原理和步驟:
一、原理
膜蛋白酵母雙雜交技術利用酵母細胞膜蛋白的兩個域——DNA結合域和激活域來構建分子載體。其中DNA結合域可與DNA序列結合,并具有轉錄激活功能的激活域可激活下游基因的轉錄。通過將兩個要檢測的蛋白質分別融合到這兩個域上,形成酵母細胞膜蛋白與目標蛋白質的融合蛋白,若融合蛋白能形成復合物,則激活下游基因的轉錄,酵母細胞生長,反之則不生長。這樣就可以通過檢測酵母細胞的生長情況來判斷目標蛋白質之間是否存在相互作用。
二、步驟
1、構建膜蛋白酵母雙雜交載體
膜蛋白酵母雙雜交載體通常包括兩個部分:酵母表面膜蛋白的DNA結合域(BD)和激活域(AD)。點突變或保留的氨基酸序列將目標蛋白質或其片段接入到BD或AD中。
2、轉化酵母細胞
將構建好的BD和AD載體分別轉化入兩個酵母菌株中,在培養基中篩選出具有BD和AD融合的酵母細胞菌落。
3、半定量或定量檢測生長
將BD和AD融合的兩種酵母細胞混合在含有不同濃度的抗性劑和缺失選擇性基因的培養基上。如果兩種酵母細胞中的融合蛋白質可以相互作用,則會激活下游的選擇性基因,使酵母細胞生長,并且一定時間后成為明顯的菌落。然而,如果兩種酵母細胞中的融合蛋白不能相互作用,則不會生長菌落。
半定量檢測方法:將要檢測的酵母細胞分別稀釋后點在含有不同濃度的抗性劑和缺失選擇性基因的培養基上, 一般以濃度級差為1:5,1:10或1:100。培養2~4天后觀察生長情況即可。
定量檢測方法:將自感和雜交酵母細胞的混合物均勻涂布于含有不同抗性劑濃度的平板上后,計算細胞增殖的程度,從而確定相互作用強度的差異。
4、確認相互作用
通過對生長的酵母細胞進行重復自由浸潤篩選,進一步檢驗融合蛋白量的特異性、真實性和重復性。可以使用其他實驗來進一步證實相互作用,如質譜法、共免疫沉淀法等。
通過膜蛋白酵母雙雜交技術,可以快速檢測目標蛋白質之間的相互作用,并且具有靈敏度高、可重復性好的優點。該技術已成功應用于細胞信號傳導和蛋白質在生命活動中的作用研究。
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