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靶點(diǎn)蛋白敲除方法

日期:2023-05-31 13:57:46


    靶點(diǎn)蛋白敲除是基因組編輯技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的一種。傳統(tǒng)的方法是使用外源DNA片段替換目標(biāo)基因的編碼區(qū)域,這種方法被稱為基因敲除。隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)在還出現(xiàn)了一些更加高效和精準(zhǔn)的方法,例如CRISPR/Cas9系統(tǒng)、TALEN、ZFN等。

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一、傳統(tǒng)的基因敲除方法
 
1、全部敲除法

    這種方法是將目標(biāo)基因的全部編碼區(qū)域替換為外源DNA片段。首先,通過PCR擴(kuò)增得到目標(biāo)基因的上下游序列,并將其克隆入質(zhì)粒載體中,構(gòu)建成敲除載體。然后,將該載體導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中,使其進(jìn)行重組,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的敲除。使用這種方法可以完全清除目標(biāo)基因,但往往需要較長(zhǎng)的外源DNA片段,很難實(shí)現(xiàn)精確敲除,因此不太適合進(jìn)行基因組宏大的研究。
 
2、部分敲除法

    這種方法是在目標(biāo)基因上引入一個(gè)位點(diǎn)突變,以使該基因不能正常運(yùn)作。在這種情況下,由于敲除的部位僅限于編碼區(qū)域的一部分,因此需要較短的外源DNA片段,更加容易實(shí)現(xiàn)精確敲除。常用的方法是利用CRISPR/Cas9技術(shù)或者TALEN技術(shù)進(jìn)行基因敲除。
 
二、基因組編輯技術(shù)

1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種高效的基因組編輯技術(shù),它可以通過簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)和構(gòu)建sgRNA來實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的敲除。其中,sgRNA的作用是與Cas9蛋白結(jié)合,在目標(biāo)位點(diǎn)上形成一個(gè)雙鏈斷裂,從而引發(fā)細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制,最終導(dǎo)致目標(biāo)基因的敲除。與其他方法相比,CRISPR/Cas9技術(shù)具有效率高、精確度高、快速、便捷等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為基因組編輯領(lǐng)域最為常用的工具之一。
 
2、TALEN技術(shù)

    TALEN技術(shù)是另一種基因組編輯技術(shù),也可以用于實(shí)現(xiàn)基因敲除。它利用特異性核酸酶切割目標(biāo)基因的DNA序列,從而導(dǎo)致目標(biāo)基因的敲除。與其他方法相比,TALEN技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性和更低的假陽(yáng)性率,但是需要設(shè)計(jì)和合成更加復(fù)雜的分子,相對(duì)而言還需要更多的時(shí)間和資源。

3、ZFN技術(shù)

    ZFN技術(shù)是一種基于人工合成的鋅指蛋白的核酸結(jié)合能力來定向切割目標(biāo)基因的DNA序列,并從而實(shí)現(xiàn)基因敲除的技術(shù)。類似于TALEN技術(shù),ZFN也需要設(shè)計(jì)和合成較為復(fù)雜的分子,并需要進(jìn)行構(gòu)建和驗(yàn)證,因此較為耗時(shí)和費(fèi)力。
 
三、總結(jié)
 
    靶點(diǎn)蛋白敲除是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù),在基因組編輯技術(shù)的發(fā)展過程中,不斷有新的技術(shù)涌現(xiàn),以提高敲除效率和精度。傳統(tǒng)的基因敲除方法包括全部敲除法和部分敲除法,但由于其精確性、效率等方面的局限性,已經(jīng)逐漸被CRISPR/Cas9系統(tǒng)、TALEN和ZFN等技術(shù)所取代。這些新技術(shù)具有更高的效率和更低的假陽(yáng)性率,對(duì)于基因敲除和其他基因組編輯技術(shù)的研究提供了更強(qiáng)大的工具和手段。


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